HR0187 真菌蛋白提取试剂盒(2D电泳用)

特别提示：包括真菌蛋白提取试剂盒(2D电泳用)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床YL及其他非科研用途！

产品名称：真菌蛋白提取试剂盒(2D电泳用)

英文名称：Fungal protein extraction kit (2D electrophoresis)

产品货号：HR0187

产品规格：50T|100T



真菌蛋白提取试剂盒(二维电泳用)适用于从各种真菌中提取总蛋白。优化的裂解液配方可以充分释放各种真菌样本蛋白，提取过程简单方便，可在1小时内完成。该试剂盒含有的蛋白酶YZ剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高纯度的蛋白提供了保证。提取的蛋白用于二维电泳。如需要用于SDS-PAGE电泳检测、Western blotting、凝胶阻滞实验、免疫共沉淀、报告基因检测、酶活分析等下游实验的试剂盒，请联系本公司，选择其他货号产品。



储存条件：蛋白酶YZ剂-20℃保存；蛋白提取液室温保存。

有效期：一年。



注意事项：

●本试剂盒仅供科学研究使用。

● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管底，避免开盖时试剂损失。

● 禁止与其他品Pai的试剂混用，否则会影响使用效果。

● zuì好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清洗并彻底清除残留清洁剂。

● 避免皮肤或粘膜与试剂接触。



试剂盒以外自备试剂和仪器：

● 移液器、吸头 ●离心机及离心管 ● 涡旋振荡器 ●冰箱，冰盒

使用注意事项：

● 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。

● 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。

●蛋白酶YZ剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。

●可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶YZ剂单品。



使用方法：

1．提取液制备：每500μl真菌蛋白提取液中加入2μl蛋白酶YZ剂混合物，混匀后备用。

2．取培养真菌样本，在4℃，3000g条件下离心5-10分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集菌体。

3．用冷PBS 洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。

4．将菌体置于研钵中用液氮研磨5分钟左右至粉末。若无液氮研磨条件，可直接用蛋白提取液研磨。

5．每100mg 菌体中加入500μl蛋白提取液，混匀后，振荡30-45分钟。

6．在14000g条件下离心15分钟。

7．将上清吸入另一干净离心管，即可得到真菌总蛋白。

8．将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验②。

注：

① 菌体数量根据实验情况调整，每次的裂解液用量并不是一定的，请根据实际情况调整。

②蛋白样品－80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。



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名称：包涵体大量纯化试剂盒

货号：BTN90510

规格：2次

本产品是包涵体微量纯化试剂盒的大提升级产品，用于大量，快速的提取高质量的包涵体。



产品特点：

1.大量提取，1次可处理多达5升的菌液，相当于50次中量提取。

2.适合制备级别的包涵体纯化，需在50mL以上的离心管或离心瓶中完成。

3. 能有效去除包涵体中的细胞壁和细胞膜等非重组蛋白成份，使重组蛋白在包涵体中所占比重达到60%以上。

4. 即可以选择高压裂解法，也可以采用酶学裂解法裂解细菌。

5. 得到的包涵体可以用于重折叠，也可以用于凝胶层析和动物免疫。



试剂盒组成：

成分	规格
溶液A	100mL
溶液B	250mL×2
包涵体溶解液	100ml
溶菌酶	100mg
说明书	1份

储存条件：常温运输，4℃保存(溶菌酶需要-20℃保存，包涵体溶解液可以室温保存)，有效期一年。



自备试剂：如果得到的重组蛋白确有降解则需要自备蛋白酶YZ剂混合物(BTN80808)。



使用方法：



一．细胞沉淀：

1．转移1-5升菌液到干净的、预称重量的塑料离心瓶中。如果离心瓶体积不够大，可以分多次反复离心收集。

2．5000g(相当于Sorvall GSA转头5500rpm)4℃离心15-30分钟，小心弃上清。

3．复称重量，差值就是细菌的湿重。1升的过夜培养的大肠杆菌湿重一般为3克，所以1-5升菌液一般能得到3-15克细菌。注意：后续操作的很多溶液都是按此步得到得细胞湿重添加。

4．细胞沉淀可以立即使用或存放在-80℃待用。



二．细胞裂解(下面两法中选其一)：

 高压破碎法(French Press)+超声法(推荐方法)

1．按每克细菌湿重加入3mL溶液A重悬细胞，可以用玻璃棒搅拌或用Waring捣碎机匀浆(如果细菌湿重超过10克)使细菌悬浮，直到检测不到成块的细胞为止。如有必要，可以加入溶菌酶干粉，使其终浓度为0.2mg/mL。

2．让细胞通过压力为16000-18000 lb/in2的高压细胞破碎仪，收集的细胞裂解液需放冰上。

3．重复上步操作一次或多次，直到绝大部分细菌都被裂解。注意：每次处理后zuì好在显微镜下检查细菌裂解的比例。

4．将细胞裂解液置于冰浴中，用超声破碎仪满功率下超声处理5分钟，工作状态为50%(开0.5秒，关0.5秒)。此过程中zuì好将细胞裂解液放冰上并用磁力搅拌器搅拌，否则产生的热量会使包涵体蛋白变性，在纯化中丢失。

 酶法+超声法(在没有高压破碎仪器时方法)

1．按每克细菌湿重加入3mL的含溶菌酶的溶液A重悬细胞，可以用玻璃棒搅拌细菌沉淀使之悬浮。

2．在细菌悬浮液中加入溶菌酶干粉，使其终浓度为0.2mg/mL，搅拌混匀后37℃放置30分钟裂解细菌，其间不时需要用玻璃棒混匀。细菌释放出的DNA将使裂解物变得十分粘稠。如果不粘稠，说明裂解不充分，需要继续裂解，否则完整细菌将和包涵体一起沉淀，影响包涵体的纯度。由于处理量大，zuì好在显微镜下检查细菌是否充分裂解。

3．将细胞裂解液置于冰浴中，用超声破碎仪满功率下超声处理5分钟，工作状态为50%(开0.5秒，关0.5秒)。此过程中zuì好将细胞裂解液放冰上并用磁力搅拌器搅拌，否则产生的热量会使包涵体蛋白变性，在纯化中丢失。



三．包涵体纯化：

1．将超声处理的细胞裂解液转移到离心瓶中，22000g 4℃下高速离心60分钟(注意：转子不同其对应的离心速度不同)，小心收集上清。上清含有以可溶形式存在的重组蛋白，可以保留作为SDS-PAGE对照样品。

2. 将沉淀(主要由包涵体构成)悬浮在预冷的溶液B中。每克细菌需要5mL溶液B，1升细菌的湿重约3克，大约需要15mL溶液B，用玻璃棒或匀浆器搅拌混匀后室温放置5分钟。

3．22000g 4℃下高速离心30分钟，沉淀将出现三层，zuì下面的是未彻底破裂的细胞碎片，其上是包涵体，zuì上层的松软沉淀是细胞壁和细胞外膜。如果处理过程中使用过溶菌酶，则此层较薄。小心收集上清，可以作为包涵体次洗涤的对照样品。

4．重复第8-第9步直到上清变清和zuì上层细胞壁和细胞外膜松软沉淀消失，此过程一般需要重复洗涤2次(共3次洗涤)，小心收集上清作为包涵体第二次洗涤和第三次洗涤的对照样品。本试剂盒提供的溶液B足够一次5升规模的提取洗3次，如需更多溶液B请单独购买。

5．上步得到的沉淀即为包涵体，其中重组蛋白一般占60%重量，其余40%为其他蛋白质。此沉淀可以长期放置在-80℃冰箱待用，也可以直接用于免疫动物制备抗体，还可以直接进入下面得包涵体的溶解步骤。

6．估计重组蛋白的产率：首先需要通过预实验知道重组蛋白的表达水品，如果表达水平为1%，则1克湿重的细菌中将含有1mg重组蛋白质。此法得到的重组蛋白质的回收率一般在75%，即1mg重组蛋白质能得到0.75mg，丢失0.25mg。



四．包涵体的溶解：

1．在室温下，将包涵体溶解液加入到包涵体沉淀中，用枪头充分吹打后漩涡震荡。如果需要将溶解的包涵体直接用于凝胶过滤层析进一步纯化，则按每克原始细胞湿重加入1mL包涵体溶解液，重组蛋白的浓度约为4-5mg/mL；如果需要将溶解的包涵体直接用于蛋白质折叠，则按每克原始细胞湿重加入3mL包涵体溶解液，重组蛋白的浓度约为1-2mg/mL；注意：包涵体溶解液低温放置会产生沉淀，必须45-65℃溶化并混匀后才能使用。

2．室温放置1小时使蛋白质充分溶解。

3．100,000g 4℃离心60分钟(转速需要根据离心机转子的大小换算)，小心收集上清，保留不溶性沉淀。注意：检查离心管能否承受此离心力。SDS-PAGE检查是否大部分重组蛋白都在上清中。如果没有，说明包涵体没有完全溶解，需要用适当增加包涵体溶解液的用量。

4．将上清(溶解的包涵体)分成10-20mL一份，放于塑料离心管中(不要超过离心管容量的70%)置-80℃长期保存或直接用于复性等试验。由于不同的蛋白质有不同的zuì佳复性条件，需要用户自己摸索。包涵体纯化过程中引入了溶菌酶，在SDS-PAGE分析时可能有额外条带出现。



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