SYA004 单增李斯特氏菌单重荧光PCR检测

特别提示：包括单增李斯特氏菌单重荧光PCR检测试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床YL及其他非科研用途！

产品名称：单增李斯特氏菌单重荧光PCR检测试剂盒

产品货号：SYA004

产品规格：48次/盒



本试剂盒适用于增菌培养物、疑似病料及食品中单增李斯特氏菌(Lm)的检测，其检测结果仅供参考。



本试剂盒用一对单增李斯特氏菌特异性引物，结合一条特异性荧光探针，用一步法荧光PCR技术对单增李斯特氏菌DNA进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染



者的病原学诊断。本试剂盒中单增李斯特氏菌的探针报告基团为FAM。



试剂盒组成：

组份	数量	规格
单增李斯特氏菌荧光qPCR反应液(Lm-qPCR MIX)	1 管	720μL/管
DNA抽提液(DNA Extraction)	2管	1.5mL/管
阴性对照(NTC)	1管	50μL/管
阳性对照(Lm-PTC)	1管	50μL/管

储存条件：-20℃，有效期6个月。



使用方法：



一、样品采集：

?食品样品：样品的采集与预培养按照《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》(GB 4789.30-2010)要求进行。

?粪便样品：取粪便置于灭菌的收集管中送检。

?病灶部位样品：取发病部位新鲜渗出物、粘液脓血送检。

 注：上述样品建议经过增菌后，收集培养物用于检测。



二、DNA提取：

可采用PCR试剂盒配备的DNA抽提液，按以下说明进行DNA核酸的粗提。也可采购北京百奥莱博科技有限公司生产的DNA提取试剂盒(过柱法-荧光配套)或其他合适的



商业化产品，并按照相应试剂盒说明进行操作。

?液体培养物：取液体培养物100μL加到1.5mL无菌离心管中，8000rpm离心3min，尽量吸弃上清，加入50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm



离心3min，取上清5μL进行PCR反应。

?固体培养物：挑取单克隆菌落与50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min，取上清5μL进行PCR反应。

?粪便样品：挑取米粒大小粪便于灭菌离心管中，加入0.5mL生理盐水，振荡混匀，13000rpm离心3分钟，弃上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混匀，100℃



恒温10min，13000rpm离心3min取上清5μL进行PCR反应。

?其他液体标本：取标本2-3mL，13000rpm离心3min，弃上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min取上清5μL进行PCR



反应。

 注：建议采用相关标准方法进行前增菌，并按照6.2.1方法进行提取。阳性对照和阴性对照为已经抽提好的核酸(无需提取)，直接取5μL加入到反应体系中即可。



由于阳性对照浓度较高，建议zuì后在样品制备区域加入阳性对照。



三、检测步骤：

1．试剂的准备

从试剂盒中取出荧光PCR反应液(Lm-qPCR MIX)，室温融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。

设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：

试剂	每个反应加入的量	N个反应加入的量
荧光PCR反应液	15μL	N×15μL

计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL，向每管中加入处理后样品/阴



性对照(NTC)/阳性对照(Lm-PTC)5μL，10000rpm瞬时离心10秒。

2．qPCR反应条件

将各反应管放入实时荧光PCR仪器的反应槽内。推荐循环条件：

	1循环	50℃ for 2 min
预变性	1循环	95℃ for 10 min
PCR扩增	40循环	95℃ for 15 sec 60℃ for 60 sec

在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM，淬灭基团：NONE，请勿选择ROX参比荧光。



四、结果分析：

1．结果分析条件设定

直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的zuì高点为准。

2．试验成立判定

?阴性对照(NTC)：不应产生任何的扩增曲线。

?阳性对照(Lm-PTC)：均产生扩增曲线，且Ct值≤30。

?以上条件应同时满足，否则，此次试验视为无效。

3．结果判定

?在试验成立的条件下，Ct值≤30的样本为阳性，表明Lm核酸阳性。

?Ct值显示为无的样本为阴性样本，表明Lm核酸阴性。

?如果30＜Ct值≤35，判为可疑样品。对于可疑样品，先看扩增曲线。如果扩增曲线为对数扩增曲线，则为可疑阳性，否则判为阴性。

?对于可疑阳性样品，重新抽提核酸，再次进行Lm qPCR检测。如果重复扩增曲线为对数扩增曲线，则判为样本阳性，表明Lm核酸阳性；否则判为样本阴性。



五、注意事项：

?初次使用前请仔细阅读说明书。并严格按照说明书步骤操作。

?所有使用的离心管应高压灭菌，而且必须不含DNA酶。

?PCR操作应严格按照要求分区(试剂配制区、标本处理区、PCR扩增区等)，防止实验室污染。

?样本提取、试剂配置、加样需在不同区的超净工作台进行，以免污染。

?试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。



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规格：48次/盒



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规格：48次/盒

一、简介：

本试剂盒用一对立氏立克次体特异性引物，结合一条特异性探针，用荧光PCR技术对立氏立克次体的核酸进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。



二、用途：

该试剂盒适合于检测全血等样本中的立氏立克次体，用于立氏立克次体感染的辅助诊断，其检测结果仅供参考。



三、试剂盒组成：(48T)

组份 数量 规格

立氏立克次体反应液(qPCR MIX) 1管 720uL/管

DNA抽提液(DNA Extraction) 2管 1.5mL/管

阴性对照(NTC) 1管 50μL/管

立氏立克次体阳性对照(PTC) 1管 50μL/管



四、储存条件及有效期：

本试剂盒于-20℃以下保存，有效期为6个月。



五、荧光PCR仪器适用范围：

ABI系列、MJ系列、Roche系列，博日系列及其他荧光定量PCR检测仪。



六、样品采集、前处理与DNA提取

6.1 样品的采集

用注射器取血5mL至EDTA-2Na抗凝管。

6.2 样本前处理

取抗凝血下层血细胞50uL，加入100uL双蒸水吹匀。

6.3 DNA提取

可采用PCR试剂盒配备的DNA抽提液，按以下说明进行DNA核酸的粗提。也可采购北京百奥莱博科技有限公司生产的DNA提取试剂盒(过柱法-荧光配套)或其他合适的商业化产品，并按照相应试剂盒说明进行操作。

对上述处理好的样本加入等体积核酸提取液(固体标本加入50μL核酸提取液)，100℃恒温处理10min，13000rpm离心5min，取上清液转移至新的1.5mL EP管，-20℃保存；

 注：阳性对照和阴性对照为已经抽提好的核酸(无需提取)，直接取5µL加入到反应体系中即可。由于阳性对照浓度较高，建议zuì后在样品制备区域加入阳性对照。



七、检测步骤

7.1 试剂的准备

从试剂盒中取出荧光PCR反应液(qPCR MIX)，冰上融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。

设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：

试剂 每个反应加入的量 N个反应加入的量

荧光PCR反应液 15µL N×15µL

计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL荧光PCR反应液，向每管中加入处理后样品/阴性对照(NTC)/阳性对照(PTC)5μL，10000rpm瞬时离心10秒。

7.2 qPCR反应条件

将各反应管放入实时荧光PCR仪器的反应槽内。

推荐循环条件:

1循环 50℃ for 2 min

预变性 1循环 95℃ for 10 min

PCR扩增 40循环 95℃ for 15 sec

60℃ for 60 sec

在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM。淬灭基团：NONE，请勿选择ROX 参比荧光。



八、结果分析

8.1 结果分析条件设定

直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的zuì高点为准。

8.2 试验成立判定

（1） 阴性对照：不应产生任何的扩增曲线。

（2） 阳性对照：均产生扩增曲线。

（3） 以上条件应同时满足 ，否则，此次试验视为无效。

8.3 结果判定

（1） 在试验成立的条件下，Ct值≤35的样本为阳性，表明立氏立克次体核酸阳性。

（2） Ct值显示为无的样本为阴性样本，表明立氏立克次体核酸阴性。

（3） 如果Ct值>35，判为可疑样品。对于可疑样品，先看扩增曲线。如果扩增曲线为对数扩增曲线，则为可疑阳性，否则判为阴性。

（4） 对于可疑阳性样品，重新抽提核酸，再次进行立氏立克次体 qPCR检测。如果重复扩增曲线为对数扩增曲线，判为样本阳性，表明立氏立克次体核酸阳性；否则判为样本阴性。



九、注意事项：

（1） 初次使用前请仔细阅读说明书。并严格按照说明书步骤操作。

（2） 所有使用的离心管zuì好高压灭菌，而且必须不含DNA酶。

（3） PCR操作应严格按照要求分区(试剂配制区、标本处理区、PCR扩增区等)，防止实验室污染。

（4） 样本提取、试剂配置、加样需在不同区的超净工作台进行，以免污染。

（5） 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。





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