WE0118 结核分枝杆菌基因分型试剂盒

特别提示：包括结核分枝杆菌基因分型试剂盒(VNTR-9)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床YL及其他非科研用途！

产品名称：结核分枝杆菌基因分型试剂盒(VNTR-9)

英文名称：TB Typing Kit(VNTR-9)

产品货号：WE0118

产品规格：50次



  本试剂盒是以分子流行病学zuì新研究进展为基础，经工艺优化后形成的人型结核分枝杆菌基因分型产品。本产品利用结核分枝杆菌基因组中可变数目串联重复序列(variable-number tandem repeats, VNTR)多态性进行基因型分型区分临床菌株，是研究结核分枝杆菌分子流行病学和监测结核病传播状况的有力工具。与现有其它基于VNTR原理的结核分枝杆菌VNTR分型系统相比，这一分型系统对ZG流行的菌株具有更强的分辨能力，因此特别适合于ZG用户的需求。



  通过对各PCR反应引物序列和预混反应液成份进行精心优化，使得本产品具有很强的抗干扰力。与用户自配试剂相比，本产品显著提升了特异条带信号强度，降低了使用粗制模板(煮沸菌液)时非特异条带的出现率，使实验操作更加简便、快捷的同时，提高了检测成功率。本产品的预混反应液化学稳定性良好，能有效抵抗反复冻融(10次)和较长时间(一周)的室温环境，更好地适应了用户检测工作中的灵活性需求。



  本产品将人型结核分枝杆菌(MTBC)鉴定、非结核分枝杆菌(MOTT)及模板质量鉴定、结核分枝杆菌北京家族菌株鉴定，和后续的9位点VNTR分型鉴定整合在一个试剂盒中，使用户仅需一个试剂盒、12个PCR反应即可获得待测菌株基因型鉴定所需的完整信息。检测的分辨力指数(Hunter-Gaston index，HGI)可达0.989 。并且，基因型鉴定结果可数字化记录，使得不同样本批次，不同地区，不同时间，不同研究者之间的实验数据可以很方便地进行比对和汇集分析，极大地提高了数据的使用效率。



  对鉴定为VNTR-9基因型成簇(所有9个位点具有相同重复数)的样本，若要判定菌株间是否存在近期传播关系，需使用配套产品TB基因分型试剂盒HV-3(货号WE0119)，做进一步的分型鉴定。VNTR-9与HV-3两个产品的结合使用可将检测的HGI提升至0.993 。关于TB基因分型试剂盒HV-3(货号WE0119)产品的更多信息请见其产品说明书。



根据您的关注的结核分枝杆菌基因分型试剂盒(VNTR-9)，您可能还对以下产品有需求：







名称：PCR级高GC的DNA清除剂

货号：BTN61203

规格：1.5mL

本产品是我司开发的专门用于富含GC的DNA模板扩增的试剂。



产品特点：

1.GX，使用效果普遍好于常规的添加DMSO和甜菜碱的方法。

2.可以处理GC含量高达80%的DNA模板。

3. 操作简单，将本产品用于溶解DNA沉淀即可使用。



储存条件：常温运输及保存，有效期一年。



使用方法：

将乙醇沉淀的高GC DNA直接溶解在适量的本产品中，充分吹打均匀，然后直接将DNA加入PCR反应体系中进行PCR反应。加入的DNA溶液zuì好不要超过PCR终体积的1/10。剩余的DNA可以长期保存。



名称：2%明胶溶液(PCR级)

货号：BTN70905

规格：1.5mL

大量实验显示一定比例的明胶能够促进PCR反应。本产品为2%的明胶溶液，按1/5到1/20(具体取决于PCR反应体系)的比例加入到PCR反应体系中，可以提高PCR的效率。



储存条件：低温运输、-20℃保存，有效期一年。



名称：可调式易错PCR试剂盒

货号：BTN160903

规格：100次

易错PCR是利用Taq DNA多聚酶不具有3′→5′校对功能的特性，在一定条件下(如不同的dNTP浓度、Mg浓度和MnCl2存在)能够按较高的机率引入随机引入突变。如果有适当的选择方法，则可从构建的突变库选出所需突变体。易错PCR和常规PCR的比较如下：





产品特点：

1. 即开即用，十分简单方便，尤其在生物制药和酶学研究领域显示出了它的优越性。

2. 配方经过精心优化，实验人员在一定范围内可以控制突变率，一轮PCR的突变率范围在2-8突变/1000bp，更高的突变率可以通过多轮PCR达到。

3.可用于连续易错PCR，只需把上一次易错PCR的产物用作下一次易错PCR的模板即可，使每一次获得的小突变累积而产生重要的有益突变。

4.可以扩增的DNA片段更长，达到3kb，对于3kb以上的产物，建议分段扩增。



试剂盒组成：

成分	规格
Taq DNA聚合酶(5U/μL)	100μl
易错PCR专用dNTP 2.0,10×	300μl
易错PCR Mix 2.0,10×	300μl
易错PCR专用MnCl2	300μl
易错PCR专用dGTP	300μl
超纯水	1ml

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期为一年。



使用方法：



1. 将模板DNA稀释到1ng/uL。将引物稀释到10uM。

 注意：引物是决定易错PCR成败的关键因素，设计引物时要保证其Tm在70℃，长度在25-30nt之间，GC含量在45%-60%之间，3端GC含量低，并且没有发夹结构。

2. 根据每1000bp的预期突变数按下表确定易错PCR的反应条件中MnCl2和dGTP的用量。表中的A表示易错PCR专用的MnCl2，B表示易错PCR专用的dGTP：

预期突变数	2个	3个	4个	5个	6个	7个	8个
A的用量(μl)	0	1.0	2.5	4.0	4.0	4.0	4.0
B的用量(μl)	0	0	0	1.0	2.0	3.0	4.0

3.以30μL的标准PCR反应体系为例，如果反应体系不是30μL，各成分需要按等比例增加或减少。在一干净的PCR管中，加入下列成分

 注意：可以先计算出超纯水的用量，优先加水

成分	用量
超纯水	根据第2步加
易错PCR Mix,10×	3μl
易错PCR 专用dNTP，10×	3μl
易错PCR 专用MnCl2	根据上步
易错PCR 专用dGTP	根据上步
自备DNA模板(1ng/μl)	1μl
自备PCR引物(10μM each)	1μl each
Taq DNA聚合酶(5U/μl)	1μl

4. 按已经优化的PCR条件进行一定循环数的PCR(循环数与突变率的关系见下表)，然后取5μL电泳检查。如果没有优化的PCR条件，一般可以先尝试下面的PCR条件(对1Kb长的模板而言)：

PCR前变性	94℃ 3分钟
易错PCR(循环30次)	94℃ 1分钟
	45℃ 1分钟
	72℃ 1分钟

注：易错PCR一般不需要热启动，也不需要在PCR结束后做延伸处理。长度每增

加1Kb，时间延长1分钟。易错PCR循环次数决定每个核苷酸位置的突变几率，进而决定每个PCR产物可能的突变位点数，所以所需循环数由客户根据需要改动。

5.电泳检测是否得到预计长度的PCR产物。

6. 克隆片段进行功能筛选、或者克隆后进行测序分析突变率、或者用此轮PCR的产物为模板，进行下一轮的易错PCR。



疑难解答：

Q：现象：没有PCR产物。

A：可能原因：一是引物没有优化，可以重新设计引物；二是模板DNA太少，可以增加用量；三是模板不纯，zuì好先胶回收；四是溶解DNA的溶液中有EDTA，降低了PCR反应体系的Mg离子浓度，可以适当补加Mg离子。

Q：现象：太多的PCR条带或PCR条带模糊一片。

A：可能原因：一是PCR循环数太多；二是复性温度太低；三是延伸时间太长；四是引物没有优化，可以重新设计引物；五是PCR条件没优化，可以使用touch-down PCR；六是模板有其他DNA污染；七是DNA模板质量不高或者浓度太高。

Q：如果需要更高的突变率，如何办？

A：可以使用连续多次易错PCR来提高突变率。但zuì好先用胶纯化回收PCR片段,再用于下一轮易错PCR。此外不能用少于千分之一的次PCR产物作为第二轮易错PCR的模板，否则多样性将受到影响。第三轮易错PCRzuì好使用所有第二轮的PCR产物作为模板，但需要在10mL体系中完成(可以分成很多100μL体系进行)。