SiMax II质粒DNA小量提取试剂盒

 SiMax II质粒DNA小量提取试剂盒使用说明概 述本实验方法的基本原理是，在高盐状态下，硅胶膜专一性地吸附DNA；而在低盐或水溶液状态下，DNA被洗脱下来。此法简便快捷，可在30分钟内同时提纯二十多个样品。从3～5ml培养过夜的含高拷贝质粒的菌液中可以获得10～20µg高纯度的质粒DNA，用于酶切、转化、DNA自动测序和手工测序等。
 试剂盒包装及组成                                50次

1. 悬浮液(溶液I)         7ml
2. 裂解液(溶液II)        10ml
3. 中和液(溶液III)       10ml
4. 结合液                     25ml
5. 洗脱液                     2.5ml
6. 离心纯化柱B           50套
7. 产品说明书             1份

实验前注意事项※溶液IZ好于4℃保存，使用前移至室温，待试剂温度达到室温后再使用；其它试剂于室温保存。
※室温低于25℃时，溶液可能出现结晶或盐析，此时请务必预热，使其完全溶解后使用。用户自备的仪器及试剂

1. 台式高速离心机
2. 1.5ml或2ml林习惯及离心管架
3. 100ul、1000ul移液器及吸头
4. 80%异丙醇或80%乙醇 

操作方法1. 将3～5ml菌液13,000rpm离心30秒收集沉淀（菌体）。
如果用1.5ml或2ml离心管则需反复离心2～3次。
2. 倒掉上清，将沉淀（菌体）完全悬浮于100µl悬浮液(溶液I)中。
上清要尽可能去除干净，可用滤纸吸干。沉淀要用混旋器完全悬浮，否则将直接导致下一步的裂解不彻底，进而影响质粒DNA的产量和纯度。
3. 加入150µl裂解液(溶液II)，轻柔地颠倒混匀10次左右，溶液逐渐变得
粘稠、清亮。
不可用混旋器剧烈振荡，否则会使质粒DNA断裂；裂解时间不宜超过5分钟，否则会造成染色体DNA的污染。
4. 加入150µl中和液(溶液III)，轻柔地颠倒混匀10次左右。
此时可见到白色絮状的染色体DNA及细菌碎片。
5. 13,000 rpm离心8～10分钟，将上清液小心转移入一个新的1.5ml离心管中，加入等体积(约400µl)的结合液，颠倒混匀。
6. 将混和液吸入离心纯化柱中，静置至少3分钟，13,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。
   此步使处于高盐状态下的质粒DNA与硅胶膜结合后，离心去除杂质。
7. 将纯化柱重新套入废液收集管中，加入600µl 80%异丙醇(或80%乙醇)，13,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。
如果纯化柱底部残留有异丙醇（或乙醇），可用滤纸吸干，否则将影响以后的酶促反应。此步是洗涤质粒DNA中混有的杂质及盐类。
8. 重复第7步一次，尽可能将杂质及残留的异丙醇或乙醇去除。
9. 取出纯化柱，将其套入一个干净的1.5ml离心管，开盖放置2~3分钟，使乙醇充分挥发干净。加入50µl 洗脱液（若用于测序，则加50µl超纯水）于硅胶膜上，不能粘在管壁上。室温下放置5分钟后，13,000rpm离心1分钟。
     离心柱放入离心管中，若盖不上盖子，亦没有关系，可开盖离心。洗脱液或无菌超纯水的用量视用户对浓度的要求而定，但超纯水的洗脱效率不如专门的洗脱液。
10. 将洗脱液重新吸入纯化柱中，再洗脱一次。这样可以获得较高产量的质粒DNA。
11. 离心管中收集的液体即是洗脱下来的质粒DNA，取1～2µl电泳（0.8%琼脂糖，120V，15～20分钟）检测其纯度并目测定量。
若发现有RNA污染，可加入0.5µl RNaseA (10mg/ml)，37℃保温30分钟。此操作不影响其后续实验。补充说明※如果起始菌液体积较大或收集的菌体较多，溶液I、II、III的用量及其它试剂可相应放大。但操作略有不同，需要时我们乐于提供帮助。
※实验证明，少量的RNA污染对于酶切、转化及测序无明显的影响。
 
 
常见问题及参考意见

常见问题	可能原因	参考意见
质粒产量低	细胞裂解不充分	减少培养物体积。对于高拷贝质粒，培养物体积不要超过5ml，低拷贝质粒培养物体积不要超过10ml
		按比例增加溶液I与溶液II的体积，使菌体充分悬浮，然后完全裂解细胞
	非转化细胞的大量生长	必须在选择条件下扩增质粒DNA
	定量不准确	通过琼脂糖凝胶电泳进行观察及定量
	不合适的保存条件	将质粒DNA溶于无菌超纯水或TE中，于-20℃保存
	菌液培养的时间过长	在新鲜的选择平板上挑选一个分隔良好的单菌落，于37℃振荡培养12～16小时
	质粒的拷贝数太低	增加培养物体积，但不要超过10ml
	溶液II及结合液有结晶出现	将溶液II及结合液置于37℃温浴30min以上，使结晶完全溶解，且在使用前要充分混匀
	洗脱温度过低	加入无菌超纯水或者洗脱液浸透硅胶膜后，于37~50℃温育2分钟
	洗脱液pH<7.0	用TE或pH>7.0的无菌超纯水洗脱
洗脱液中没有质粒DNA	质粒DNA漂出点样孔	增加甘油或蔗糖助沉
	质粒丢失	在新鲜的选择平板上挑选生长良好的单克隆进行细菌培养
		对质粒DNA进行重新转化
	杂菌污染	在选择平板上挑选生长正常的菌落进行摇菌
电泳时质粒呈现额外条带	开环质粒DNA及线状质粒DNA的存在	加入裂解液后，轻轻混匀，时间不要超过5min
	可能存在缺失突变体	有些质粒如cosmids长期保存于E.coli中是不稳定的，在摇菌时应在选择平板上挑选新鲜的，分隔良好的单克隆
电泳时质粒呈现额外条带	存在质粒多聚体	单酶切后，质粒多聚体酶切为线状质粒DNA,可与染色体DNA的污染相区别
	存在变性的超螺旋质粒DNA	加入裂解液(溶液II)后，碱裂解时间不要超过5分钟

 
 

RNA污染	菌体过量，导致RNaseA相对量不足	减少培养菌液的体积
	溶液I放置时间超过6个月	于100µl溶液I中加入1µl RNaseA (10mg/ml)或于洗脱液中加入0.5µl RNaseA ，37℃温育30min以上
染色体污染	混合操作过于剧烈	加入溶液II、溶液III之后，轻柔地颠倒混匀，不要剧烈振荡
	裂解时间过长	裂解时间不要超过5分钟
	细菌培养期间，出现细胞裂解	菌液的培养时间不要超过12～16小时
质粒DNA降解	核酸酶的存在	更换菌株，有些菌株，例如HB101、TG1、JM100等含有高水平的核酸内切酶活性
		使用灭菌的玻璃及塑料制品
		用无菌超纯水或TE洗脱质粒DNA
质粒DNA在下游操作过程中出现问题	盐的浓度过高	用80%乙醇漂洗质粒DNA
		增加漂洗次数
	缺口质粒DNA的存在	减少菌液培养的体积
		更换菌株，情况可能会变好
	蛋白质未去除干净	检查菌液体积、培养基、菌株生长状况等
		增加漂洗液的体积及漂洗次数
	残留有有机试剂	增加离心时间，将80%乙醇或异丙醇去除干净

 
 
欢迎咨询QQ:2060346634, 微信公账号：sbs赛百盛 咨询电话:4006663029 Email:web@sbsbio.com

关注微信公众号享受更多折优惠，请关注后给公众号并留言获取报价。