实时荧光定量PCR技术服务（普通基因，siRNA,miRNA ）

实时荧光定量PCR（Real Time PCR，qRT-PCR）避免了传统PCR 以终产物检测定量产生的偏差，提高实验的重复性。与常规PCR 相比，实时荧光定量PCR 具有特异性更强、有效解决PCR 污染问题、自动化程度高等特点，已成为国际公认的核酸分子定量的标准方法。该技术已被广泛用于检测细胞mRNA 表达量的变化；比较不同组织的mRNA 表达差异；验证基因芯片，siRNA 干扰的实验结果。它涉及到DNA或RNA 样品制备，反转录及PCR 反应等一系列重要的分子生物学过程。

配套产品：qPCR实时荧光定量一步法试剂盒  BK2100BK   BK2100 

设计目的片段和内参基因的qPCR引物：利用Primer5.0等软件设计PCR引物及探针。我们公司免费为客户设计引物和探针。

SYBR Green 法
1）建立以下反应体系
试剂（SYBR Green法）量
总RNA 根据实验
qPCR mix（包含MLV、Hot-start Taq、dNTP等 ） 终浓度为1×
SYBR Green I solution 终浓度为1×
上游引物，10μM 终浓度：~200 nM
下游引物，10μM 终浓度：~200 nM
MgCl2 根据实验
RNase-Free H2O To 25.0 μl

2） PCR 反应条件如下：
步骤 循环数 步骤温度 时间
逆转录 1 1 42 oC 30 min
失活MLV，激活Taq 1 1 95 oC 10 min
1 95 oC 15 sec
2 X oC* 实时荧光定量PCR 40 30 sec
3 72 oC 30 sec
*与引物的Tm 相关
3） 取5μl PCR 产物跑1.5%琼脂糖凝胶电泳，或做溶解曲线，检测PCR 产物的特异

   

                                                                      荧光图谱                                                             

Taqman 法
1） 建立以下反应体系
试剂（Taqman法） 量
总RNA 根据实验
qPCR mix（包含MLV，Hot-start Taq、dNTP等 ）
终浓度为1×
Taqman Probe 根据实验
上游引物，10μM 终浓度：~200 nM
下游引物，10μM 终浓度：~200 nM
MgCl2 根据实验
RNase-Free H2O To 25.0 μl

2） PCR 反应条件如下：
步骤 循环数 步骤温度 时间
逆转录 1 1 42 oC 30 min
失活MLV，激活Taq 1 1 95 oC 10 min
1 95 oC 15 sec
实时荧光定量PCR 40
2 60 oC* 1 min
3实验完毕之后，将数据导入到Excel 中进行数据分析。
4.结果分析：
利用ΔΔCt 法，相对定量，将目的基因的表达与看家基因的表达对比，获得沉默效果。