德国DBI进口荧光定量pcr试剂

Bestar™Real time PCR Master Mix(SYBR Green法)

产品名称	Bestar™ Real time PCR Master Mix (SYBR Green法)
DBI-2043	200Reaction
DBI-2044	1000Reaction
DBI-2073	40Reaction

●储存条件
-20°C长期保存；反复冻融不影响使用效果；如果频繁使用，建议储存于4°C。
●产品简介
Ø本产品是采用SYBRGreen I嵌合荧光法进行Real Time PCR的专用试剂。产品中含有Real Time PCR反应的Z适浓度SYBRGreen I，进行实验时，PCR反应液的配制十分方便简单。
Ø本产品Buffer经过优化改良，可以YZ非特异性反应，能够在更广的范围内进行准确定量。
Ø本产品可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对目的基因进行准确定量、检测，重复性好，可信度 高。
Ø试剂盒中荧光定量MIX中已经添加合适浓度的荧光定量ROX校正染料，实验时无需额外添加，直接可以进 行ROX校正实验。

重要提示： 本产品中使用经过化学修饰Bestar™ Taq DNA Polymerase，与其他公司的抗体型Hot Start用DNA聚合酶相比，90℃以下避免了副反应的产生，需要PCR反应前的95℃ 2分钟酶的活性化反应。如果高温处理时间太短，会使酶的活性下降，其PCR的扩增效率、定量精度等都会受到影响。如果在PCR反应前进行模板的预变性，推荐设定为95℃ 2分钟。

●操作方法
◆用ABI PRISM 7000/7700/7900HT，7300 System的操作方法
请按照Applied Biosystems公司的仪器使用说明书要求进行实验操作（其它类型的荧光定量PCR仪器请按照说明书操作）。
1）按下列组份配制PCR反应液：

试剂名称	使用量
Bestar™ Real time PCR Master Mix (SYBR Green法)	10ul	12.5ul	25ul
PCR Forward Primer（10 μM）	0.5ul	0.5ul	1ul
PCR Reverse Primer（10 μM）	0.5ul	0.5ul	1ul
DNA模板	1ul	1ul	2ul
ddH2O（灭菌蒸馏水）	8.0ul	10.5ul	21ul
Total	20ul	25ul	50ul

备注：
1.在20ul反应体系中，DNA模板的添加量通常在100 ng以下。因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定的DNA模板添加量。
2.如果欲使用本产品进行2 Step RT-PCR反应的第二步PCR扩增反应，步的RT反应液作为DNA模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。

3.96孔板、Single-Tube、8联Tube采用50ul反应体系，384孔板、96-well Fast Thermal Cycling plate采用20ul反应体系。

2）进行Real Time PCR反应。
建议采用下列显示的三步法PCR反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR条件的优化。
三步法PCR扩增标准程序：
Stage 1：预变性
Reps：1
95℃ 2min
Stage 2：PCR反应
95℃ 10秒
50-60℃ 30～34秒*40 cycles
72℃ 30秒
* 退火温度根据引物来设定。
使用7700和7900HT时请设定在30秒。
使用7000和7300时请设定在31秒。
使用7500时请设定在34秒。
Stage 3: 融解曲线
95℃1min
55℃ 1min
55℃-98℃ (10sec/cycle 0.5℃/cycle) 86cycles
3）实验结果分析。
反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。