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keyFluor647-Annexin V/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒

产品信息
  • 一、 试剂盒说明
    在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（ PS ）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（ PS ）由脂膜内侧翻向外侧。 Annexin V 是一种分子量为 35~36kD 的 Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白 ，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此 Annexin V 被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将 Annexin V 进行荧光素 PE 标记，以标记了的 Annexin V 作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。
    7-AAD （7-amino-actinomycin D）是一种核酸染料，它不能通过正常质膜，随着细胞凋亡、细胞死亡过程，质膜对7-AAD的通透性逐渐增加，结合细胞凋亡中DNA的有控降解，在合适波长激发光的激发下可发出明亮的红色荧光，通过7-AAD标记DNA的强弱，将细胞分为三群：7-AAD强为死亡细胞，7-AAD弱是凋亡细胞，7-AAD-为正常活力细胞。7-AAD同PI 有着相似的荧光特性，但其发射波谱较PI窄，对其他检测通道的干扰更小，在多色荧光分析中是PI 的替代品，可与Annexin V- PE联合使用。
    本试剂盒可应用于培养细胞凋亡检测（ 不推荐用于检测组织样本 ）。
    二、 试剂盒组份

     
    组份 Cat: KGA
    10 assays    		 Cat: KGA
    20 assays    		 Cat: KGA
    50 assays    		 Cat : KGA
    100 assays    		 储存条件
     
    AnnexinV-PE 50 μ L 100 μ L 250 μ L 500 μ L 4 ℃ 避光
    7-AAD 染液 50 μ L 100 μ L 250 μ L 500 μ L 4 ℃ 避光
    Binding Buffer 5 mL 10.0 mL 25 mL 50 mL 4 ℃

    三、 试剂盒以外自备仪器和试剂
    流式细胞仪或荧光显微镜、低速离心机、微量移液器
    1.5m L  Microtube 、载玻片、盖玻片（荧光显微镜观察需用）、 PBS 、不含 EDTA 的胰酶消化液
    四、 使用注意事项
    1．   微量试剂取用前请离心集液。
    2．  Annexin V-PE/ 7-AAD 避光保存及使用。
    3．  7-AAD 为潜在致癌物，操作时请采取防护措施，穿防护服、戴手套等。
    4．  本试剂盒适用于检测活细胞，流式细胞仪检测时，细胞数量不以应低于 1×105 ， ，不推荐用于检测组织样本。
    5．  推荐使用悬浮培养细胞。如果是贴壁细胞，建议适用不含 EDTA 的胰酶消化，如消化不当，可能引起假阳性，而用细胞刮子会造成细胞粘连成团，而影响检测。可将胰酶消化后细胞的保存在含 2%BSA 的 PBS 中，防止进一步的损伤。
    6．  细胞固定后可能导致荧光的淬灭，请不要固定样品。
    7．   因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同，因而流式检测的荧光补偿也不同，因此建议每次检测均需使用未经凋亡诱导处理的细胞作为对照，进行荧光补偿的调节。
     
     
    五、操作方法
    1．   悬浮细胞离心（ 2000rpm 离心 5min ）收集；贴壁细胞用 不含 EDTA 的胰酶 消化收集（ 注：胰酶消化时间不易过长，否则容易引起假阳性）；
    2．   用 PBS 洗涤细胞二次（ 2000rpm 离心 5min ）收集 1~5×105 细胞；
    3．   在 50 μ L 的 Binding Buffer 中加入 5 μ L 7-AAD 染液 ，混匀；
    4．   收集细胞中加入 上述 7-AAD 染液 ，混匀；室温、避光、反应 5 ～ 15min ；
    5．   反应后再加入 450 μ L 的 Binding Buffer 混匀；
    6．   加入 1 μ L Annexin V-PE 混匀；室温、避光、反应 5 ～ 15min ；
    7．   请在 1 hour 内，进行下述荧光显微镜或流式细胞仪的观察和检测。
    A．  荧光显微镜观察
    1．   滴一滴上述染色后的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞；
    2．   对于贴壁细胞来说，也可直接用盖玻片来培养细胞并诱导细胞凋亡；
    （1）         将细胞于盖玻片上生长，用适当的凋亡诱导剂诱导细胞凋亡，并设立阴性对照组；
    （2）         用 PBS 洗涤细胞两次；
    （3）         在 500 μ L 的 Binding Buffer 中加入 1 μ L Annexin V-PE ， 5 μ L 7-AAD 染液 混匀；
    （4）         将上述溶液滴加于盖玻片表面，使长有细胞的盖玻片表面均匀覆盖；
    （5）         避光、室温反应 5 min 。
    3．   将盖玻片倒置于载玻片上，于荧光显微镜下滤光片（罗丹明）观察 Annexin V-PE 荧光信号呈橙红色； 激发波长546nm，发射波长647 nm ，观察 7-AAD 荧光信号呈红色。
    B．    流式细胞仪分析
    用流式细胞仪检测，激发波长 Ex=488 nm; 发射波长 Em=578 nm ， Annexin V- PE 的橙红色荧光建议使用 FL2 通道检测； 激发波长 Ex=546 nm; 发射波长 Em=647 nm ， 7-AAD 红色荧光建议使用 FL3 通道检测。
    荧光补偿调节：使用未经凋亡诱导处理的正常细胞，作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。
    六、 凯基相关产品 （详见凯基网站 http://www.keygentec.com.cn ）
    细胞株、细胞提取物及细胞培养产品
    ¨            人类肿瘤细胞株    鼠肿瘤细胞株   正常细胞株  肿瘤耐药细胞株
    ¨             细胞提取物（RNA/DNA/蛋白）    细胞培养相关产品
    细胞凋亡
    一、细胞凋亡研究试剂盒
    ¨         Annexin V-FITC/ EGFP/PE 细胞凋亡检测试剂盒
    ¨         TUNEL 凋亡原位检测系列试剂盒
    ¨         Caspase(2 、3、6、8、9)系列细胞凋亡检测试剂盒
    ¨         线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）    TRAP-PCR端粒酶活性检测试剂盒    DNA Ladder检测试剂盒
    二、细胞凋亡相关抗体              三、凋亡诱导剂、YZ剂
    四、氧化应激损伤检测试剂盒        五、细胞凋亡研究辅助试剂
    细胞增殖/毒性/活力与细胞周期
    凯基细胞周期检测试剂盒     MTT 、XTT、WST-1、CCK-8等系列细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒
    细胞染色产品
    活细胞/凋亡细胞/坏死细胞鉴别试剂盒（AO/EB法.荧光显微镜）    凯基细胞凋亡形态学检测试剂盒
    罗丹明123、DAPI、PI、 7-AAD 、Hoechst 33258、EB、吖啶橙染色试剂盒
    亚细胞组分制备
    ¨         细胞核、线粒体制备试剂盒     □ 细胞悬液制备试剂盒（组织消化试剂盒）
     
    温馨提示：不可用于临床ZL。
    温馨提示：不可用于临床ZL。
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