超灵敏化学发光免疫印迹发光底物、WB发光底物液、HRP发光液

赫利森超灵敏化学发光免疫印迹检测试剂盒（UltraSensitive Western Blot Kit）是用于免疫印迹技术中辣根过氧化物酶(HRP)检测的高灵敏增强型检测试剂盒。该产品基于新一代增强型化学发光底物研制而成，在HRP的催化下发生化学反应而发光，可用于检测固定在膜上的HRP或HRP标记蛋白等生物大分子。其高灵敏度能够检测低皮克（pg）级别的抗原，发光信号强烈持久，可以使用照相技术 (X-光胶片曝光) 或者其它成像方法检测。
主要用途： 用于免疫印迹、蛋白芯片等发光实验。
特征/优点：
1． 灵敏度高，可以清晰检测出低皮克级（10 pg -100 pg）的蛋白含量；
2． 特别适用于成像检测
3． 稳定性好，A、B单独存放2－8℃避光条件下12个月，发光值衰减小于5%。图1：赫利森超灵敏化学发光免疫印迹检测试剂盒（UltraSensitive Western Blot Kit）与Pierce及Roche同类产品的对比。在同样条件下，赫利森的产品的灵敏度是Pierce产品的4倍以上，是Roche产品的8倍以上。

使用方法：将 A液和 B 液取出，平衡至室温，1:1 混合均匀后使用。
保存条件：避光、2-8℃
有 效 期：12个月
操作步骤：（参考）
1. 二抗孵育完毕后，将印迹膜充分洗涤。
2. 根据需要量，将增强型发光剂和稳定剂按照1：1 的比例等体积混合，配制为化学发光检测底物工作液（例如：一张8 cm × 6 cm 的膜使用1 mL工作液）。
3. 弃去洗涤缓冲液，将发光底物工作液滴加在印迹膜上，确保工作液覆盖整张膜，室温孵育5 分钟。
4. 去掉多余发光底物工作液，将印迹膜置于两层干净的塑料薄膜之间，此过程应小心完成，避免膜与膜之间产生气泡。
5. 在暗室内进行X-光胶片曝光，或将膜放置到荧光、化学发光成像仪内，按照仪器说明书进行检测。
6. 如果曝光胶片背景较高，可将此印迹膜漂洗2 次，每次3 分钟。重新按需要量配制工作液，并在工作液中加入背景YZ剂，工作液与背景YZ剂建议比例为10 : 1-20 : 1（例如：1 mL 增强型发光剂 + 1 mL 稳定剂配制成工作液中加入100-200 μL 背景YZ剂），重复3-5 步骤进行曝光。

注：一抗推荐用量为20 ng/ml - 1 μg/ml，二抗推荐用量为4 ng/ml - 20 ng/ml。

注意事项：
1． 为获得实验结果，请务必优化实验条件，包括检测样品的用量、一抗、二抗稀释度、杂交膜及封闭试剂的选择。
2． 由于奶粉中含有内源性生物素，在使用亲和素/生物素系统时，封闭液中应避免使用奶粉。
3． 建议在封闭缓冲液及所有抗体稀释液中加入高质量的吐温-20（终浓度为0.05%），以减少非特异性结合。
4.  由于叠氮钠是HRPYZ剂，在缓冲液中应避免使用叠氮钠作为防腐剂。
5.  免疫印迹实验进行全过程中，请确保印迹膜始终处于湿润状态，避免干燥。
6.  为获得实验效果，抗体孵育及膜洗涤步骤中请使用摇床辅助完成。
7.  在与膜发生接触过程中请佩戴手套或者使用洁净镊子，避免蛋白污染。
8.  实验过程中，请使用洁净器材。保证非金属设备没有明显划痕，金属设备表面无锈。锈可能导致膜上带有污点或者高背景。
9.  避光条件下，配制好的化学发光检测底物工作液可在室温下稳定保存8小时。如暴露于阳光或其他强光下，工作液会受影响。为获得效果，可于棕色瓶中配制工作液，避免强光长时间的照射。正常实验室灯光短时间照射不影响工作液的使用。

表1. 常见问题及解决办法

问题	可能原因	解决方法
1． 胶片反相（白色条带，黑色背景）；2. 膜上出现棕色或黄色条带; 3. 暗室中看到强烈发光; 4. 发光信号持续时间过短（<24小时）	系统中HRP过量	稀释HRP标记物
信号较弱或者无信号	发光反应系统中HRP 过多，消耗底物过快，引起信号迅速降低	稀释HRP标记物
	抗原/抗体量不够	增加抗原/抗体使用量
	蛋白转移率低	优化转移系统
高背景	系统中HRP过量	稀释HRP标记物
	封闭不足	优化封闭程序
	封闭试剂选择不当	选择另一种封闭试剂
	冲洗不充分	增加冲洗时间，次数
	曝光过度	减少曝光时间
	抗原/抗体浓度过高	降低抗原/抗体使用浓度
蛋白条带为点状	蛋白转移失败	优化转移过程
	膜未平衡	按照说明书处理膜
	胶片与膜之间有气泡	曝光前去除所有气泡
膜上斑点背景	HRP共轭物成团	用0.2微米过滤器过滤HRP共轭物
出现非特异条带（高背景、信号维持时间较短）	系统中HRP 过多	稀释HRP 标记物
出现非特异条带（背景干净信号维持时间正常）	一抗用量过多	进一步稀释一抗