动植物膜蛋白微量制备试剂盒50 次

动植物膜蛋白微量制备试剂盒50 次二：细胞裂解
5. 如果用本产品 A 型，用 1 mL 冰浴的新鲜配制的细胞裂解液（1 mL 1×PBS 缓冲液+50 uL 溶液 A+ 25 uL 10 mg/mL 的 PMSF 溶液）重悬细菌沉淀，冰上超声裂解菌体直到在显微镜下看见绝大多数细胞破裂。超声参数需根据仪器型号自行摸索，一般选 1K-10K 频率处理 15 次，每次20 秒，间隔 1 分钟（必需放置在冰上）。裂解物不能粘稠，否则会堵塞
层析柱。
6. 如果用本产品 B 型，在 1 mL 冰浴的新鲜配制的细胞裂解液（在 20 mL1×PBS 缓冲液中加入所有 30 mg 溶菌酶干粉，溶解后分装成 1 mL/管，取一管使用，剩余的-20℃放置）中加入 25 uL 10 mg/mL 的 PMSF 溶液和 1 uL Benzonase，用此混合液重悬细菌沉淀后冰上放置 30 分钟，得到细菌裂解物。
7. 将超声或酶法细胞裂解物在 13000 g 4℃离心 10 分钟去除未裂解细胞和裂解细胞碎片以防堵柱，所得上清即含可溶性 GST 标记蛋白。
三：层析柱的制备和 GST 蛋白纯化
8. 摇晃将谷胱甘肽-Agarose 介质充分混匀后，取适量加入到预放了一片筛板的层析柱中（介质用量需要根据 GST 蛋白产量决定，100 mL 菌液一般使用 200 uL 介质即可）。下列步骤各溶液的用量均针对 200 uL 介质而定，如果介质用量不同，各溶液用量需相应调整。
9. 用 5 mL 预冷的 1×PBS 缓冲液洗柱。
10.将第 7 步得到的上清液（含可溶性 GST 标记蛋白）上柱，让重力使上柱液自然流出，收集并保存穿透液用于 SDS-PAGE 电泳。GST 和谷胱甘肽之间的结合很缓慢，所以流速一定不能快，否则结合不充分。流速一般在 0.2-1 mL/分钟即可。如要提高 GST 标记蛋白与介质的结合效率，可用本试剂盒提供的红盖将层析柱下的漏液口堵上，让细菌裂解液和介质在4℃结合 30 分钟或过夜。也可以将穿透液反复上柱。
11.用 0.5-2 mL 1×PBS 缓冲液洗柱，收集并保存穿透液（含杂蛋白）。
12.用 0.2-1 mL GST 洗脱液洗柱，收集并保存穿透液（含 GST 标记蛋白）。由于可能含蛋白酶污染，所以穿透液不能在 4℃放置，需立即用于后续处理（如浓度测定或 SDS-PAGE 电泳）或-80℃长期放置。
13.对收集的 2 种穿透液和洗脱液进行蛋白定量或 SDS-PAGE 分析。注意：如果不预先脱盐，则只能用 Bradford 法或 OD 检测法（1 OD280 约等于 0.5 mg/mL 蛋白）测定穿透液和洗脱液的蛋白浓度。由于 GST 的分子量为 26 KD，所以在 SDS-PAGE 胶上，GST 标记蛋白将比天然蛋白大 26 KD。
原理及特点:
重组蛋白 N 端的 GST 谷胱甘肽 S 转移酶（Glutathione S Transferase）能提高重组蛋白的水溶性，所以常用于蛋白质重组表达。GST-谷胱甘肽亲和层析是利用 GST 标记的蛋白能与谷胱甘肽层析介质结合，并能被还原型谷胱甘肽洗脱的特点而建立，是目前分离纯化 GST 标记蛋白质的重要方法。本产品就是专门用于上述目的，具有下列
动植物膜蛋白微量制备试剂盒50 次特点：
1. 一站式套装，含所需的谷胱甘肽介质、溶液和层析柱，用户只需要提供表达 GST 标记蛋白的细菌（酵母、杆状病毒、培养细胞）即可，非常方便。
2. 专一性强，一次过柱即可获得纯度高达 95%的 GST-标记蛋白。
3. 只能在非变性条件下使用，只可用于纯化没形成包涵体的 GST 标记蛋白。
4. 每次可以处理 20 mL 的表达菌液，适合初步筛选和鉴定。
5. 提供 4 mL 浓度为 50%的谷胱甘肽-Agarose 介质，可吸附 5-10 mgGST 标记蛋白质。
6. 本介质可以反复使用多次。
一:重组蛋白的表达和细菌收集
1. 37℃振荡培养 20 mL 含表达质粒的细菌到 OD600=0.6-0.8。
2. 加 IPTG 到终浓度为 0.1 mM，30℃振荡培养 3 小时或 22℃振荡培养 8小时（或过夜）。
3. 4℃ 5000 g 离心 10 分钟收集 20 mL 表达菌液，弃上清。
4. 用 1×PBS 缓冲液重悬细菌沉淀，4℃ 5000 g 离心 10 分钟，弃上清。沉淀可直接用于裂解或放-80℃保存。

小鼠Corin蛋白(CRN)elisa试剂盒，英文名：CRN ELISA Kit

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小鼠CD3d分子(CD3d)ELISA试剂盒，英文名：CD3d ELISA Kit

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小鼠CD30配体(CD30L)ELISA试剂盒，英文名：CD30L ELISA Kit

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小鼠Ⅵ型胶原α1(COL6α1)ELISA试剂盒，英文名：COL6α1 ELISA Kit

小鼠Ⅴ型胶原α2(COL5α2)ELISA试剂盒，英文名：COL5α2 ELISA Kit

小鼠Ⅳ型胶原α1(COL4α1)ELISA试剂盒，英文名：COL4α1 ELISA Kit

小鼠Ⅳ型胶原(COL4)ELISA试剂盒，英文名：COL4 ELISA Kit

小鼠Ⅲ型前胶原氨基端原肽(PⅢNP)ELISA试剂盒，英文名：PⅢNP ELISA Kit

小鼠Ⅲ型胶原交联羧基端肽(CTXⅢ)ELISA试剂盒，英文名：CTXⅢ ELISA Kit

小鼠Ⅲ型胶原(COL3)ELISA试剂盒，英文名：COL3 ELISA Kit

小鼠Ⅱ型前胶原羧基端原肽(PⅡCP)ELISA试剂盒，英文名：PⅡCP ELISA Kit

小鼠Ⅱ型前胶原氨基端原肽(PⅡNT)ELISA试剂盒，英文名：PⅡNT ELISA Kit

小鼠Ⅱ型胶原交联羧基端肽(CTXⅡ)ELISA试剂盒，英文名：CTXⅡ ELISA Kit

小鼠Ⅱ型胶原(COL2)ELISA试剂盒，英文名：COL2 ELISA Kit

小鼠ⅡD组磷脂酶A2(PLA2G2D)ELISA试剂盒，英文名：PLA2G2D ELISA Kit

小鼠ⅡA组磷脂酶A2(PLA2G2A)ELISA试剂盒，英文名：PLA2G2A ELISA Kit

小鼠Ⅰ型前胶原羧基端原肽(PⅠCP)ELISA试剂盒，英文名：PⅠCP ELISA Kit

小鼠Ⅰ型前胶原氨基端原肽(PⅠNP)ELISA试剂盒，英文名：PⅠNP ELISA Kit

小鼠Ⅰ型前胶原(PCⅠ)ELISA试剂盒，英文名：PCⅠ ELISA Kit

小鼠Ⅰ型胶原交联羧基端肽(CTXⅠ)ELISA试剂盒，英文名：CTXⅠ ELISA Kit

小鼠Ⅰ型胶原交联氨基端肽(NTXⅠ)ELISA试剂盒，英文名：NTXⅠ ELISA Kit