BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型) 蛋白质研究

名称：BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型) 蛋白质研究
规格：500T
编号：SY0298
品Pai：百奥莱博
产地：国产|进口
该BCA蛋白浓度测定试剂盒可用于比色皿法检测，也可用于微孔板法检测。前者虽需较大量（100μl）的蛋白样品，但由于其在检测中使用蛋白样品与BCA工作液的比率为1:20（v/v），从而降低干扰物质带来的影响。后者操作简单方便，仅需少量（10-25μl）的蛋白样品。不过，由于其在检测中使用蛋白样品与BCA工作液的比率为1:8（v/v），某种程度上限制干扰物质的承受浓度以及降低检测水平。我司提供三种规格的BCA蛋白浓度检测试剂盒，比色皿法分别可做50次，250次，500次。酶标法分别可做500次，2500次，以及5000次。

BCA（Bicinchoninic acid）法是目前应用比较广泛的蛋白质浓度测定方法。基于双缩脲反应，即在碱性环境下蛋白质将Cu2+还原成Cu+，产生一种紫蓝色复合物，在562nm处有高的吸光值，该反应产物的量与蛋白质浓度成正比。BCA蛋白浓度测定法实现了蛋白质浓度测定的简便、灵敏、快速和稳定性。试剂盒中提供的蛋白标准品为用户制作标准曲线提供了便利。


产品特点

1)灵敏度高，Z小检测蛋白量可达0.2μg，检测浓度下限达到10μg/ml。
2)速度快，比一般的BCA蛋白浓度测定试剂盒显色所用时间短。比传统的Lowry法检测速度约快4倍。
3)线性范围广，20-2000μg/ml浓度范围内有较好的线性范围。
4)不受大部分样品中的化学物质的影响，可以兼容样品中5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween 20，60，80等。

储存条件：室温，有效期一年。

注意事项
1)使用BCA蛋白测定法测定时颜色会随着时间的延长不断加深，并且显色反应的速度和温度有关，因此需注意保持定时和定温，以确保精确定量。
2)低温或长期保存，若发现BCA试剂A或者试剂B有沉淀发生。请37ºC温育并伴随搅拌促使其充分溶解。如发现细菌污染，则应丢弃，避免对实验结果造成影响。
3)实验操作规范，提高上样量的精确度。
4)每次测定都需做相应的标准曲线，因为显色反应与温度和时间的变化有关，JZ的蛋白定量宜每次都做标准曲线。

操作方法

一、配制标准品和工作液
1. 配制BSA标准品体系
注：标准品稀释液为蛋白样品的溶解液，原则上蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但也可用0.9%的NaCl或1×PBS进行稀释。
BSA标准品体系配制可参考表一。

Vial	稀释液体积(μl)	2mg/ml BSA体积(μl)	BSA终浓度(μg/ml)
A	0	100	2000
B	25	75	1500
C	50	50	1000
D	125	75	750
E	150	50	500
F	350	50	250
G	375	25	125
H	395	5	25
I	400	0	0=Blank
表一BSA标准品体系配制（微孔板检测，线性范围20-2000μg/ml）*

*如用比色皿检测，每管需加100μl标准品，按3个重复计算，每个浓度至少需配制300μl。

2. 配制BCA工作液

1)计算所需要的总BCA工作液体积。
总BCA工作液体积=（标准品+待测样品）×重复数×每个样品所需要的BCA工作液
注：比色皿检测时每个样品加2.0ml BCA工作液，微孔板检测每个样品加200μl BCA工作液。

2)配制BCA工作液：50体积的BCA试剂A中加入1体积的BCA试剂B（A:B=50:1） ，充分混匀。
注：BCA试剂B加入BCA试剂A中后，迅速浑浊，通过混匀后立即变澄清。BCA工作液装入密封容器内，室温条件24h稳定。

二、检测方法

1. 比色皿检测方法（样品：BCA工作液=1:20）
1)各取100μl标准品和待测样品加入到反应管中。
2)每管加入2.0ml BCA工作液，混匀。37℃孵育30min。
注意：也可室温孵育2h，或者60℃孵育30min。BCA检测蛋白浓度，延长孵育时间会加深颜色反应。升高温度会加快显色反应。但是温度升高和时间延长会降低检测下限，以及降低工作线性范围。若蛋白浓度很低，可在较高温度孵育或者适当延长孵育时间。
3)冷却到室温。在分光光度计上进行检测，设定波长为562nm。用装满水的比色皿对仪器校零。然后在10分钟内对所有样品读数。
注意：由于BCA反应达不到真正的反应终点，即使温度降低至室温生色反应液会继续。但是，由于室温下生色比率相当低，因此若是10min内能对所有的样本进行562nm吸光度的测试，不会导致明显错误。
4)根据BSA标准品的吸光度（减去标准品中空白孔的OD值即的读数），绘制标准曲线（X-蛋白浓度ug/ml；Y-的OD562nm）。依据标准曲线和样品的稀释倍数计算样品蛋白浓度。

2. 微孔板检测方法（样品：BCA工作液=1:8）
1)各取25μl标准品和待测样品加入到微孔板中。
注：样品与工作液比例为1:8，若样品有限，可使用10μl标准品和待检测样品进行检测（即1:20），这时试剂盒的检测范围为125-2000μg/ml。

2)每孔加入200μl BCA工作液，振荡30s充分混匀。盖上微孔板，37℃孵育30min。
3)冷却到室温，在酶标仪上的540～595nm波长范围处检测吸光度，其中562nm波长为。

注意：
a）由于酶标板的光径比比色皿短，使得酶标板检测需要更好的样品：BCA工作比率来获得相同的检测灵敏度。若使用高于562nm的检测波长，建议延长孵育时间到2h。
b）延长孵育时间或者提高样品：BCA工作比会ZG每个孔的OD562nm净值，并且降低检测下限和工作线性范围。
4)根据BSA标准品的吸光度（减去标准品中空白孔的OD值即的读数），绘制标准曲线（X-蛋白浓度ug/ml；Y-的OD562nm）。依据标准曲线和样品的稀释倍数计算样品蛋白浓度。

附录：
表：BCA蛋白浓度测定的兼容性

名称	耐受浓度
Sodium bicarbonate	100 mM
Sodium phosphate	25 mM
2-Mercaptoethanol	0.01%
Glycercol (pure)	10%
Glycine-HCl, pH 2.8	100 mM
HEPES	100 mM
Hydrochloric acid	100 mM
Leupeptin	10 mg/L
Nickel chloride (in TBS, pH8.0)	10 mM
Nonidet P-40 (NP-40)	5% (w/v)
Octyl β -glucoside	5% (w/v)
Potassium thiocyanate	3.0 M
SDS	5%
Sodium acetate, pH 4.8	200 mM
Sodium azide	0.20%
Sodium hydroxide	100 mM
Sucrose	40%
Triton X-100	5%
Triton X-114, X-305,X-405	1%
Tween-20, Tween-60, Tween-80	5%
Zwittergent	1%
ACES, pH 7.8	25 mM
Acetone	10%
Acetonitrile	10%
Ammonium sulfate	1.5 mM
Aprotinin	10 mg/L
Bicine, pH 8.4	20 Mm
Bis-Tris, pH 6.5	33 mM
Borate, pH 8.5	50 mM
Brij-35	5%
Brij-52	1%
Brij-56, Brij-58	1%
BugBuster protein Extraction Reagent	no interference (undiluted)
Calcium chloride (in TBS, pH 8.0)	10 mM
CelLytic B Reagent	no interference (undiluted)
Cesium bicarbonate	100 mM
CHAPS	5%
Cobalt chloride (in TBS, pH 8.0)	0.8 mM
CytoBuster Protein Extraction Reagent	no interference (undiluted)
Deoxycholic acid	5%
Dithioerythritol (DTE)	1 mM
Dithiothreitol (DTT)	1 mM
DMF	10%
DMSO	10%
EDTA	10 mM
EPPS, pH 8.0	100 mM
Ethanol	10%
Ferric chloride (in TBS, pH 8.0)	10 mM
Glucose	10 mM
Glycerol	10%
Guanidine-HCl	4 M
Imidazole, pH 7.0	50 mM
MES, PH6.1	100mM
Methanol	10%
MOPS, pH7.2	100mM
N-Acetyglucosamine(10mM)in PBS, pH7.2	10mM
Octyl β- thioglucpyranoside	5%
PIPES, pH6.8	100mM
PMSF	1 mM
PopCulture Reagent (Cat. No. 71092)	no interference (undiluted)
Reportasol Extraction Buffer	no interference (undiluted)
Sodium chloride	1 M
Sodium citrate, pH 4.8 or pH 6.4	200 mM
Sodium ortho-vanadate in PBS, pH7.2	1mM
Span 20	1%
TBS (150 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, pH 8.0)	no interference (undiluted)
Thimerosal	0.01%
TLCK	0.1mg/L
TPCK	0.1mg/L
Tricine, pH 8.0	25 mM
Triethanolamine, pH 7.8	25 mM
Tris	250 mM
Tris(hydroxypropyl)phosphine (THP)	1 mM
Urea	3M
Zinc chloride (in TBS, pH 8.0)	10 mM

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