名称：SY0038型热启动高保真酶品Pai
品Pai：百奥莱博
编号：SY0038
规格：100U
英文名：HotStart Pfu DNA Polymerase
HotStart Pfu DNA Polymerase在Pfu DNA Polymerase的基础上添加了在常温下能够YZ5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性的两种单克隆抗体，可进行高特异性的热启动(Hot Start)PCR，扩增产物为平端。Pfu DNA Polymerase是经过基因工程改造的，新一代超保真DNA聚合酶，具有极高的扩增效率和广泛的模板适应性，可用于几乎所有PCR反应。其行进性 (processivity)得到了大幅度提升，即使是非常复杂的模板，也能准确快速的完成反应。其错配率是普通Taq酶的1/52，是Pfu酶的1/6；且扩增速度可以达到15秒/kb。
本产品中附带的5×HS Pfu buffer对于简单或复杂模板、短片段或长片段PCR扩增都具有良好的适应性。缓冲液中已经含有10 mM Mg2+ (1×终浓度为2 mM)，可以使用产品中提供的DMSO/MgSO4对反应体系进行优化。另外，产品中附带的PCR Enhancer可有助于高GC含量片段的扩增。
产品组份：
5×HS Pfu buffer(with 10 mM MgSO4)：1.25 ml
25 mM MgSO4：1 ml
dNTP Mix(10 mM each)：100 μl
HS Pfu DNA Polymerase(1 U/μl)：100 μl
5×PCR Enhancer：500 μl
DMSO：100 μl
10×Loading buffer：1.25 ml
活性定义：用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物，74℃ 30分钟内，摄入10 nmol的全核苷酸为酸性不溶物的活性定义为1个活性单位（U）。
储存条件：-20℃
质量控制：
核酸外切酶残留检测：10 U本品和0.6 μg λ-HindⅢ在74 ºC下孵育1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。
核酸内切酶残留检测：10 U本品和0.6 μg Supercoiled pBR322 DNA在74 ºC下孵育1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。
大肠杆菌残留DNA检测: 50 μl体系中，加入2U本品，以ddH2O为模板，扩增E.coil 16s rDNA基因。35个循环后扩增产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳，EB染色，无扩增条带。
功能检测1：50 μl PCR体系中加入1U本品，以100 ng人基因组DNA为模板扩增α-1-antitrypsin基因。30个循环后取10% PCR产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳，EB染色，观察到单一的8.2 kb条带。
功能检测2：50 μl PCR体系中加入1U本品，以10 ng λDNA为模板扩增30个循环，取10% PCR产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳，EB染色，观察到单一的15 kb条带。
使用方法：
1. 所有操作请在冰上进行，各组分解冻后请充分摇匀。为了防止HS Pfu DNA Polymerase的校对活性降解引物，请将聚合酶加入反应体系中。各组分使用完毕后及时放回-20℃。5×HS Pfu buffer请勿长时间敞口放置。
| ddH2O | to 50 μl |
| d5×HS Pfu buffer (with 10 mM MgSO4) | 10 μl |
| d25 mM MgSO4a | optional |
| ddNTP Mix(10 mM each)b | 1 μl |
| dDMSOc | optional |
| d5×PCR Enhancerd | optional |
| d模板DNAe | optional |
| dForward Primer(10 μM) | 2μl |
| dReverse Primer(10 μM) | 2 μl |
| HS Pfu DNA Polymerase(1 U/μl)f | 1 μl |
【注】：
a. 对于大多数PCR反应，Mg2+终浓度为1.5-2 mM。体系中已含有终浓度为2 mM Mg2+，如有需要，可用25 mM MgSO4，以0.2-0.5 mM为间隔向上摸索Mg2+使用浓度。
b. 请勿使用dUTP和带有尿嘧啶的引物或模板。
c. 扩增子GC含量>60%时加入终浓度3%的DMSO有可能会有助于扩增。
d. 推荐仅当扩增子GC含量>60%且优化条件也无法正常扩增时使用；可能会降低保真度。
e. 不同模板反应浓度有所不同，下表为50 μl反应体系推荐模板使用量：
| 模板种类/扩增长度 | ＜1 kb | 1 kb～10 kb | ＞10 kb |
| 基因组DNA | 50 ng～250 ng | 100 ng～300 ng | 150 ng～400 ng |
| 质粒或病毒DNA | 10 pg～20 ng | 10 pg～20 ng | 1 ng～30 ng |
| cDNA | 1～5 μl(不超过PCR反应总体积的1/10) |
f. 推荐的酶的终浓度为1U/50 μl反应。然而，根据扩增子的长度和复杂程度不同，可将HS Pfu DNA Polymerase在0.5-2U/50 μl反应之间进行优化。但请勿超过2U/50 μl，尤其当扩增子长度大于5 kb时。HS Pfu DNA Polymerase具有较强的校对活性。如扩增产物需要进行TA克隆，加A之前必须进行DNA纯化。
2. 推荐PCR反应条件：
| 循环步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
| 预变性a | 95℃ | 30 sec～3 min | 1 |
| 变性b | 95℃ | 5～10 sec | 25～35循环 |
| 退火c | 45℃～72℃ | 10～30 sec |
| 延伸d | 72℃ | 15～30 sec/kb |
| 彻底延伸 | 72℃ | 5～10 min | 1 |
【注】：
a. 推荐大多数模板的预变性温度为95℃，时间为：质粒或病毒DNA，30 sec，基因组2 min，cDNA 3 min；对于高GC含量模板，预变性温度需提升至98℃，变性时间为2～4 min；对于超过10 kb的扩增子，预变性温度需降低至92℃，变性时间不超过2 min。
b. 对于大多数模板在95℃变性时间设为5～10 sec即可。对于高GC含量模板，变性温度需提升至98℃；对于超过10 kb的扩增子，变性温度需降低至92℃，并延长变性时间至15 sec。
c. HS Pfu DNA Polymerase能够促进模板和引物GX退火。一般来说，退火温度设置为引物Tm值±3℃范围内之间即可。如果需要，可以建立一个温度梯度反应去寻找引物模板结合的Z适温度。退火时间太长可能导致扩增产物在胶上呈现弥散状。因此，推荐退火时间设置为10 sec即可。对于一些困难模板，退火时间可在10～30sec之间调整。
d. 对于大多数扩增反应，延伸过程可在72℃进行。对于超过10 kb的扩增片段，需降低延伸温度至68℃。延伸时间取决于扩增片段的长度和模板的复杂性。使用质粒等复杂程度较低的DNA做模板时，可使用15 sec/kb的延伸时间；使用基因组
cDNA等复杂程度较高的DNA做模板时，延伸时间应为30 sec/kb。太长的延伸时间会导致非特异性扩增增加，因此延伸时间请勿超过30 sec/kb。
3. 长片段PCR指南：
*使用高质量的模板；
*使用长引物。将引物加长至Tm值68～72℃，把退火/延伸温度合并为68℃。这样可以显著提高扩增特异性；
*适当提高酶量，但50μl反应体系内不要超过2 U；
*添加DMSO，以1%的浓度递增。调整范围为0%～6%；
*推荐反应条件设置：
| 循环步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
| 预变性 | 92℃ | 2 min | 1 |
| 变性 | 92℃ | 5～10 sec | 25～35循环 |
| 延伸 | 68℃ | 15～30 sec/kb |
| 彻底延伸 | 68℃ | 5～10 min | 1 |
4. 高GC含量模板PCR指南：
*使用高质量的模板；
*提高变性温度至98℃；
*添加DMSO，以1%的浓度递增。调整范围为0%～8%；
*添加5×PCR Enhancer；
*推荐反应条件设置：
| 循环步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
| 预变性 | 98℃ | 3 min | 1 |
| 变性 | 98℃ | 10 sec | 25～35循环 |
| 退火 | 45℃～72℃ | 10～30sec |
| 延伸 | 72℃ | 15～30 sec/kb |
| 彻底延伸 | 72℃ | 5～10 min | 1 |
引物设计注意事项:
1）引物3’端一个碱基Z好为G或者C；
2）引物3’端8个碱基应避免出现连续错配；
3）引物3’端尽量避免发夹结构出现；
4）引物的Tm值调整至55℃-65℃之间。
5）引物额外附加序列，即与模板非配对序列，不应参与引物Tm值计算；
6）引物的GC含量控制在40%-60%之间；
7）正向引物和反向引物Tm值以及GC含量尽可能一致。
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