细胞冻存、解冻方法以及细胞计数

一、细胞冷冻保存
生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO（Sigma D-2650）、无菌塑料冷冻保存管（Nalgene 5000-0020）、0.4％（w/v）trypan blue（GibcoBRL15250-061）、血球计数盘与盖玻片、等速降温机（KRYO10SeriesII）。
（1）传统方法：冷存管置于4℃10分钟→ -20℃30分钟→ -80℃16～18小时（或隔夜）→液氮槽vaporphase长期储存。-20℃不可超过1小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 
3、步骤： 
（2）配制冷冻保存溶液（使用前配制）：将DMSO加入新鲜培养基中，zui后浓度为5～10％，混合均匀，置于室温下待用。
（4）离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1～5×106Cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。 
（1）欲冷冻保存之细胞应在生长良好（logphase）且存活率高之状态，约为80–90％致密度。 
（3）注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色（以0.22micron FGLP Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650），以5～10ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。 
①normal human fibroblast:1～3×106cells/ml 
③adherent tumor lines：5～7×106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度，而HeLa只需1～3×106cells/ml 
（5）冷冻保护剂浓度为5或10％DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。 

二、冷冻细胞活化 

1、冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。 
3、材料 ：37℃恒温水槽、新鲜培养基、无菌吸管/离心管/培养瓶、液氮或干冰容器 。
（1）操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。 
（3）将新鲜培养基置于37℃水槽中回温，回温后喷以70%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。
（5）取出解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内（稀释比例为1：10～1：15），混合均匀，放入CO2培养箱培养。取0.1ml解冻细胞悬浮液作存活测试。
（7）若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。