| 实验步骤 | 材料
缓冲液和溶液
20 mmol/L HEPES(pH7.5)
10 mmol/LMgCl2
0.1%NP-40
封闭缓冲液
1% 脱脂奶粉于碱性缓冲液中
2xPK 缓冲液
20 mmol/LMgCl2
9 mmol/L 二硫苏糖醇
还原型谷胱甘肽（20 mmol/L) 于 50 mmol/L Tris-Cl(pH8.0) 中
磷酸缓冲盐溶液，含 0.2%TritonX-100
洗涤缓冲液 2
可选，请见步骤 3。
蛋白激酶 A
请见步骤 5。
Sephadex G-50 转柱
此方案步骤 5 需要含待检测蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶（请见附录 8) 或含 cDNA 表达文库的板（请见 14 章方案 2），以及附录 8 中描述的免疫印迹试剂。
这一方案适合于融合蛋白中含蛋白质激酶磷酸化位点的蛋白质（Ron and Dressler 1992)。还可采用含 cAMP 依赖的蛋白激酶识别序列的载体（Amersham Pharmacia Biotech 公司）。如果使用非标记的 GST 融合蛋白，请参见本方案结束处的文本框，“替代方案：用抗 GST 抗体检测蛋白质-蛋白质相互作用”。
方法
放射标记蛋白探针的制备
1. 在微量离心管中制备下列反应混合物：
[γ-32P]ATP(6000Ci/mmol） 5ul
蛋白激酶 A 1unit/ul
在谷胱甘肽琼脂糖上的 GST 融合蛋白 1~3ug
2XPK 缓冲液 12.5ul
水 到 25ul
反应混合物在 37°C 孵育 30 min。
在标记反应进行前融合蛋白可被蛋白酶切割。在此情形下，用切割蛋白替代标记反应中结合到谷胱甘肽琼脂糖上的蛋白质，37°C 孵育 30 min, 然后接续步骤 4。
从 SDS-聚丙烯酰胺凝胶转移的蛋白质通常可以直接被检测。如果蛋白质从 cDNA 表达文库中转移，则在进入到步骤 6 之前，可要进行附加方案：“膜结合蛋白的再折叠”。
6. 用碱性缓冲液完全覆盖膜并在 4°C 轻轻震荡淸洗 10 min。
7. 弃去碱性缓冲液，用封闭缓冲液完全覆盖膜，并在 4°C 轻轻震荡孵育 4 h 到过夜。
8. 加人 1~3ug 的贮存探针（来自步骤 3 或 4) 到足够的相互作用缓冲液中，使终浓度为 1~5nmol/L, 制备标记蛋白溶液。将膜转移到含稀释探针的平皿中，确认探针溶液与膜的整个表面均匀接触。4°C 轻轻震荡孵育 4~5 h。
9. 以适当的方式弃去放射性探针溶液。用洗漆缓冲液 1 完全覆盖膜，并在 4°C 轻轻震荡孵育 10 min。重复洗涤三次。
10. 用洗涤缓冲液 2 完全覆盖膜，并在 4°C 轻轻震荡洗涤 10 min。重复洗涤一次。
11. 用塑料包膜小心包裹膜并曝光到 X 光片上。
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