| 实验步骤 | 一 材料与设备
1)0.75mol/L 柠檬酸钠，pH7.0(含柠檬酸）, 用 0.1%DEPC 处理并高压灭菌
2)10%(m/V)N-月桂肌氨酸 (N-lauroyl sarcosine)
3) 硫氰酸胍缓冲液：用 293 ml 无菌去离子水，17.6 ml0.75mol/L 柠檬酸钠,26.4m 丨 10%N-十二醇肌氨酸钠，在厂家药瓶内于溶解 250 g 硫氰酸胍 (不用称重)
4) 抽提缓冲液：每 5 ml 硫氰酸胍缓冲液加 36ul 巯基乙醇。若被提取的组织中含多聚苯酚，抽提缓冲液中则可加入聚乙烯聚吡咯烷酮 (polyvinypoiypyrrolidone)(20%，m/m)
5) 氯仿：异戊醇 49:1(V/V)
6)2mol/L 乙酸钠，加乙酸至 pH4.0
7) 酸性苯酚:500 g 晶体苯酚溶于 500 mli 离子水中，50 ml 每份于-20℃ 保存，4℃ 可保存一个月
8) 异内醇
9)70% 和 100% 乙醇
10)2mol/L 乙酸钾，加冰乙酸至 pH4.8
11)10mol/L LiCl
12)TNE 缓冲液：10 mmol/LTris-HCl,PH7.5, 室温，15 mmol/L,NaCl，1 mmol/LEDTA
13)TE 缓冲液:l0 mmol/LTris-HCL PH7.5 1 mmol/LTEDTA
14) 研钵和研杵
15) 液氮
16) 离心机
17) 玻璃 Pasteur 吸量管，200℃ 干烤至少 3 h
收起 |
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| 注意事项 | 1) 最初的离心除去了大部分不溶性多聚糖，如淀粉颗粒。残余的组织在管的底部形成暗绿色沉淀 (若用的是叶子），不溶性多糖在残余组织上面形成灰白色胶状层
2) 当吸取上清液时，应十分小心，勿搅乱胶状沉淀，因为该层非常软。上清液的体积大约 4 ml，若因沉淀多面使液体体积明显不足时，用柚提缓冲液补足
3) 加人乙酸钾后，延长孵育时间（达 30 min) 会提高 RNA 的质景，尤其在出现蛋白污染时。多糖会形成灰白色胶状沉淀。若所用的组织多糖含量髙. 延 K 孵育时间（至 60 min) 也有助于沉淀更多的多糖
4) 加人异丙醇后，不应看到沉淀，任何可见的沉淀是表明大量多糖的存在. 孵育时间大于 60 min，就会形成多糖沉淀
5)RNA 沉淀应为白色，若有灰白色胶状沉淀则为多糖污染。遇到该情况，将沉淀再悬浮于 200ul TE, 加 1 倍体积的 2mol/L 乙酸钾，冰上孵育 30 min。12000 g，4°C 离心 20 min. 将上清液移至一新 1.5 ml 管中，用 2.5 倍体积的 100% 乙醇沉淀RNA,-20℃15 min。继续方法中的步骤 16)
6) 判断 RNA 分离的成功与否，可通过测量在 230nm、260nm、280mn 处的紫外吸收来评估 RNA 的产量和质量。若 A260/230 值小于 2, 则表明多糖和/或多聚苯酚污染；若A260/280 比值小于 1.7, 表明蛋白污染，在琼脂糖凝胶匕出现的 28S 和 18S rRNA，可用以评 估 RNA 的完整性
7) 该法提取的 RNA 适于 poly(A)+ 的分离，Northern 印迹分析，cDNA 分析，RT-PCR 扩增。 |
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