腺相关病毒包装

腺相关病毒（Adeno-associated virus，简称AAV）是一种应用广泛的转基因载体，能有效感染分裂和非分裂的哺乳动物细胞，并病毒基因组游离于细胞基因组外。因其结构简单、超低的免疫原性、GX的基因转导率、可长期稳定保存，AAV已经成为当今炙手可热的基因ZL工具。我们开发出一系列专有技术和试剂，从病毒滴度、纯度、活性以及一致性等方面显著提升了腺相关病毒包装工艺水平，对于在我们载体构建服务中用到的腺相关病毒载体尤其如此。因此， 结合我们的线上载体设计平台、线下载体和病毒生产线，我们能持续地提供高质量的定制化腺相关病毒产品。

腺相关病毒类型：

我们提供ssAAV（single-stranded AAV）和scAAV（self-complementary AAV）的包装服务，涵盖的血清型包括：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAV-DJ、AAV-DJ/8、AAV-PHP.eB、AAV-PHP.S、AAV2-retro以及AAV2-QuadYF

注意：携带目的基因的转移质粒上的ITR序列来自于AAV2。一般来说，包装不同血清型的AAV，指的是使用不同血清型的衣壳蛋白表达质粒，与携带AAV2 ITR的转移质粒进行包装。

价格和周期：

由于技术上的优势，我们的腺相关病毒包装具有更高的质量、更GX、更实惠。不同规格的腺相关病毒包装价格和周期如下所示：

 

规格	推荐使用	滴度 & 体积*	价格	周期
小规格	细胞培养	>1011 GC/ml，10x 25 ul，PBS 缓冲液	￥3100	15-25天
中规格	细胞培养	>1011 GC/ml，10x 100 ul，PBS 缓冲液	￥4600	15-25天
大规格	细胞培养	>1012 GC/ml，10x 100 ul，PBS 缓冲液	￥7700	15-25天
小规格和超纯化	动物体内	>1013 GC/ml，4x 25 ul，PBS 缓冲液	￥8500	20-30天
中规格和超纯化	动物体内	>1013 GC/ml，10x 50 ul，PBS 缓冲液	￥10500	20-30天
大规格和超纯化	动物体内	>1013 GC/ml，10x 100 ul，PBS 缓冲液	￥13100	20-30天

我们的滴度保证仅适用于包装进病毒的区域（从5’ ITR到3’ ITR）小于腺相关病毒承载限度（4.7 kb，～野生型AAV2基因组长度）的载体。超过该范围，超出4.7 kb的那部分序列在包入衣壳时会被剪切掉，导致包装出来的AAV病毒颗粒含有不完整的genome，不仅影响ITR qPCR滴度检测，而且影响转基因表达。此外，对于如下载体，我们同样不能保证滴度：
 

1. 包含对包装过程有不利影响的序列，例如毒性基因（如促凋亡基因）；破坏包装细胞或病毒的完整性（如导致细胞聚集的膜蛋白）的基因 ；易于重排或者产生二级结构的序列（如重复序列或者高GC含量序列）。
2. ⽤户提供的载体，因为我们无法控制载体质量。

周期是指订单接受到发货之间的时间。不包括需要客户提供任何物料（如病毒载体）的等待时间。

交付内容：
如果您选择非超纯化腺相关病毒包装（体外应用级别），如小规格、中规格和大规格，每个订单交付内容如下：

1. 所选规格的定制腺相关病毒
2. 免费：少量对照病毒
3. 附加购买（可选）： 等量的辅助病毒

如果您选择超纯化腺相关病毒包装（体内应用级别），如小规格和超纯化、中规格和超纯化、大规格和超纯化，每个订单交付内容如下：

1. 所选规格的定制腺相关病毒
2. 附加购买（可选）：等量的对照病毒
3. 附加购买（可选）：等量的辅助病毒

对照病毒的设计与定制化病毒的生物学应用相匹配，用于转导测试。例如，如果定制化的病毒过表达一个基因，则提供的对照病毒过表达EGFP蛋白；如果定制化病毒表达打靶某个基因的shRNA，则对照病毒表达一个scramble shRNA。对照病毒详细信息如下表所示。

辅助病毒的设计与定制化病毒的生物学应用相匹配。例如，如果定制化的病毒是一个gRNA腺相关病毒（只表达gRNA），则需要一个表达Cas9的辅助病毒，才能进行CRISPR编辑实验。

载体系统	对照载体名称	对照载体ID	定制化病毒包装规格	对照病毒数量	价格
腺相关病毒 基因表达	pAAV[Exp]-CMV>EGFP	VB150925-10026	小规格	>1011  GC/ml，100 ul，PBS缓冲液	免费
			中规格	>1011  GC/ml，2x 100 ul，PBS缓冲液	免费
			大规格	>1011  GC/ml，2x 100 ul，PBS缓冲液	免费
			小规格和超纯化	>1013 GC/ml，4x 25 ul，PBS缓冲液	￥1500
			中规格和超纯化	>1013 GC/ml，10x 50 ul，PBS缓冲液	￥2000
			大规格和超纯化	>1013 GC/ml，10x 100 ul，PBS缓冲液	￥2500
腺相关病毒 shRNA干扰载体	pAAV[shRNA]-EGFP-U6>Scramble_shRNA	VB180117-1020znr	同上	同上	同上
腺相关病毒 miR30-shRNA干扰载体	pAAV[miR30]-CMV>EGFP:Scramble_miR30-shRNA	VB180124-1104yzn	同上	同上	同上
腺相关病毒 CRISPR系统	pAAV[Exp]-CMV>EGFP	VB150925-10026	同上	同上	同上

生产、纯化和滴定：

我们常规使用的helper-free腺相关病毒包装系统包括1个转移质粒（Transfer plasmid）、1个Rep和Cap表达质粒（Rep-Cap plasmid）和1个辅助质粒（Helper plasmid），其包装过程是将携带目的基因（Gene of Interest， 简称GOI）和ITR序列的转移质粒、表达特定血清型衣壳蛋白的Rep-Cap质粒和编码介导腺相关病毒复制的腺病毒基因（E2、E2A和VA）的辅助质粒共转染包装细胞，这个转染过程称为三质粒转染（Triple transfection）。 短暂孵育后，收集细胞，裂解细胞释放病毒颗粒。对于超纯化腺相关病毒（体内应用级别），再通过氯化铯（CsCl）密度梯度离心对病毒颗粒进一步纯化和浓缩。我们采用ITR qPCR方法检测腺相关病毒滴度。

质量控制：

对于每一个我们生产的腺相关病毒，质量控制均包括滴度测定（Titer determination）、微生物（细菌和真菌）检测（Bioburden test）、支原体检测（Mycoplasma test）。若转移载体同时编码一个荧光蛋白，我们还会将病毒进行细胞转导以测定相应的荧光表达情况（Transduction test）。此外，对于超纯化腺相关病毒，我们还可以检测内毒素水平（Endotoxin test）和使用SDS-PAGE方法检测病毒纯度（Virus purity test）。