猪瘟/高致病性猪蓝耳病病毒(CSFV/PRRSV-HP)核酸检测试剂盒(RT-PCR荧光探针法)

猪瘟/高致病性猪蓝耳病病毒(CSFV/PRRSV-HP)核酸检测试剂盒(RT-PCR荧光探针法)
(一)总RNA提取
取液氮冻存脑组织置于玻璃匀浆器中，按100g:3ml的比例加入Trizol试剂，严格按照TrizolRNA提取试剂盒说明书的流程进行。
(1)加Trizol（按3ml/100mg组织，宁多勿少）置于玻璃匀浆器中匀浆后，冰浴10-15min。
(2)移入1.5mlEP管中，4ºC 13000g离心10min。
(3)上清液移至另一EP管中，室温放置10-15min。
(4)加入0.2ml氯仿/1mlTrizol，振荡15s，室温置5min。
(5)4ºC 12000g离心15min。
(6)仔细吸取上层水相，移至新的EP管中。
(7)加入0.5ml异丙醇/1mlTrizol，振摇，置室温10min。
(8)4ºC 12000g离心10min，EP管底部可见白色沉淀物。
(9)弃上清，纸巾吸干，加入75%乙醇1ml，振摇，充分洗涤沉淀。
(10)4ºC 11000g离心5min。
(11)吸尽乙醇，空气干燥10min（可离心加快干燥，尽量吸尽离心液体）。
(12)半透明时将RNA溶于去核酸酶的水20ul中（可吹打混匀），-20ºC冻存备用。
(13)所提取的总RNA用核酸蛋白分析仪分析RNA含量和纯度，所有标本260/280nm吸光度的比值均为1.8-2.0。
(14)取所提取的总RNA用1%琼脂糖凝胶电泳，显示出清晰的28s和18s两条rRNA。
猪瘟/高致病性猪蓝耳病病毒(CSFV/PRRSV-HP)核酸检测试剂盒(RT-PCR荧光探针法)
(二)逆转录反应
DEPC水 9ul
dig primer 1ul
5×buffer 4ul
10M dNTPmix 2ul
RNA酶YZ剂 1ul
总RNA 2ul 70ºC 5min
逆转录酶 1ul
20ul 42ºC 60min(+?)
70ºC 10min
4ºC ∞
(三)PCR反应
DEPC水（可用高压双蒸水） 17.5ul
10×Taq buffer 2.5ul
MgCl2 2.0ul
10M dNTP Mix 0.5ul
上游引物 0.5ul
下游引物 0.5ul
Tap酶(5u/ul) 0.5ul
总CDNA 1.0ul
25ul
PCR仪参数设置
94 ºC
5min 94 ºC ? ºC 72 ºC
30s 45s 45s 72ºC 4ºC
7min ∞
猪瘟/高致病性猪蓝耳病病毒(CSFV/PRRSV-HP)核酸检测试剂盒(RT-PCR荧光探针法)
(四)电泳
(1)20ml 0.5×TBE
0.3-0.4g琼脂糖
煮沸，配成1.5-2.0%琼脂糖凝胶（RNA为1.0%）
(2)冷切至60 ºC，加入4ulEB，倒入槽中（8孔梳），室温冷切30min
(3)拔梳，加入4ulPCR产物+1ul上样缓冲液
(4)电压100-135V
(5)UVP成像系统观察
试剂配制
5×TBE配制方法（1L计）
Tris-Base 54g
硼酸 27.5g
EDTA 3.72g
加双蒸水至1L
2%琼脂糖凝胶配制方法
琼脂糖 0.4g
0.5×TBE 20ml
EB 4ul
方法的改进版：室温冷切10min，放至4ºC冰箱20min
相关技巧
1、注意反应体系的一致，可分装
2、先P内参，检验CDNA的完整性
3、首先考虑退火温度
4、注意引物的设计
5、若目的条带无法到达指定位置，可先或晚于MAKER电泳
6、通过加量或减量PCR产物来达到灰度的调整
7、必要时可行标本间替代
8、可设计相应大小的内参来达到ZZ目的
9、2度水浴箱的妙用

1. 必要时进行相关技术处理

猪瘟/高致病性猪蓝耳病病毒(CSFV/PRRSV-HP)核酸检测试剂盒(RT-PCR荧光探针法)问题解答
无条带
反应体系错误。重新配置反应体系确保各种试剂加入的量没有问题。
PCR程序出错。检测PCR仪程序是否正确。
DNA胶问题。DNA凝胶电泳时加入阳性对照。
退火温度不合适。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。
DNA模板量太少。增加DNA模板量。
引物错误。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。
DNA模板中存在YZ剂。确保DNA模板干净
模板有复杂结构。加入DMSO,BSA或者甜菜碱。可尝试递减PCR。
PCR产物量过少
退火温度不合适。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。
DNA模板量太少。增加DNA模板量。
PCR循环数不足。增加反应循环数。
引物量不足。增加体系中引物含量。
延伸时间太短。以1kb/分钟的原则设置延伸时间。
变性时间过长。变性时间过长会导致DNA聚合酶失活。
DNA模板中存在YZ剂。确保DNA模板干净
有杂带
复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。
引物退火温度过低。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。
反应缓冲液未完全融化或未充分混匀。确保反应缓冲液融化完全并彻底混匀。
引物特异性差。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。
引物量过多。减少反应体系中引物的用量。
模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng，而基因组DNA则应<200ng。
外源DNA污染。确保操作的洁净。
猪瘟/高致病性猪蓝耳病病毒(CSFV/PRRSV-HP)核酸检测试剂盒(RT-PCR荧光探针法)条带弥散
复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。
模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng，而基因组DNA则应<200ng。
酶量过多。减少DNA聚合酶的使用量。
循环数过多。减少反应循环数至30.
引物浓度不够优化。对引物进行梯度稀释重复PCR反应。
引物错误。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。
阴性对照出现条带
试剂，枪头，工作台污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。
条带大小与理论不符
污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。
模板或引物使用错误。更换引物和模板。
基因亚型。对研究的基因进行序列分析和BLAST研究。
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