KA.PCR015.01 非洲猪瘟荧光PCR检测试剂盒

规格：50头份

介绍：非洲猪瘟(African Swine fever，East African Swine fever,ASF)，是一种急性，发热传染性很高的滤过性病毒所引起的猪病，其特征是发病过程短，但死亡率高达，临床表现为发热，皮肤发绀，淋巴结，肾，胃肠粘膜明显出血。世界卫生组织（OIE）将其列为必须通报疾病。

用途：该试剂盒用于对ASF进行检测，有助于对ASF的实验室诊断、监测和流行病调查。

原理：本试剂盒采用一步法实时荧光反转录聚合酶链式反应(One-Step Real Time RT-PCR) ，结合Taqman技术，对特异核酸进行定性或定量检测。

试剂盒的组成

	试剂名称		数量
	ASF反应液		550μL×1管
	ASF酶		40μL×1管
	ASF引物探针		100μL×1管
	无核酸水		1000μL×1管
	ASF阴性对照		1000μL×1管
	ASF阳性对照		150μL×1管

保存期及贮藏条件：本产品-20℃避光可保存12个月。

样品收集，操作和储存

1. 选择发病早期，无菌采样并立即送往实验室进行病毒检测。

2. 样品短期可在4℃冷藏保存，较长时间保存应在--20℃或者-70℃，并且避免反复冻融。

检测步骤

1.核酸提取

样品进行适当处理后，可采用本公司的核酸提取试剂盒，该试剂盒可用于对样本中病毒RNA的提取，请按照提取试剂盒说明书进行操作。也可选择其他合适的商品化产品。

2.扩增试剂的准备

将样品数+1份阴性对照+1份阳性对照设为N，计算试剂所需量，反应体系配制见下表

	试剂名称		N份用量（20μL 体系）
	ASF反应液		10μL×（N+1）
	ASF酶		0.5μL×（N+1）
	ASF引物探针		1.8μL×（N+1）
	无核酸水		5.7μL×（N+1）

将各试剂按照表中用量加入无菌离心管中，充分混匀，短暂离心后在PCR反应管中分别加入18μL混合液。

3.加样

将制备好的样本，阴性对照，阳性对照各取2μL分别加入对应反应管中，加完后盖紧PCR反应管盖，置于PCR仪上。

4.荧光PCR扩增与信号收集

	循环数		温度（℃）		时间		数据收集位点
	1		45		15min		-
	1		95		2min		-
	40		95		15s		-
			60		1min		数据收集

注：报告基团选FAM,淬灭基团选NONE。

结果成立原则

阳性对照：CT值＜30并有明显的扩增曲线。

阴性对照：无CT值或者CT值>37，线性为直线或者轻微斜线，无明显扩增曲线。

以上要求需同时满足，否则本次实验无效，需要重新进行。

结果判定

	CT值		样本检测结果
	<30并有明显的扩增曲线		阳性，样本中检测出ASF。
	30-37		可疑，需重复检测。若第二次检测CT值仍为30-37并有明显扩增曲线则判定为阳性，否则为阴性。
	>37并无扩增曲线		阴性，样本中未检测出ASF。

注意事项

1.反应体系应在特定配液区或者超净工作台中配制，整个实验过程严格控制污染。

2.PCR整个试验分配液区、模板提取区、扩增区。流程顺序为配液区→模板提取区→扩增区。严禁器材和试剂倒流。

3.使用不含荧光物质的一次性手套，一次性离心管。

4.反复冻融试剂将减低检测灵敏度，本试剂盒应在5次内用完.

5.-20℃保存的各试剂管使用前应在室温下完全融化，液体融化后需彻底混匀，2000 rpm离心15 s ，使用后立即放回-20 ℃。

6.在RNA提取过程中，避免RNA酶污染，尽量缩短操作时间。

7.注意防止试剂盒组分受污染。不要使用超过有效期限的试剂，试剂盒之间的成分不要混用。

8.PCR反应管避免气泡存在，管盖需盖紧。

9.不同批次的试剂盒勿混用。