ChIP实时定量PCR技术服务

ChIP-qPCR结合了ChIP技术和实时定量PCR技术。ChIP技术利用抗体特异性富集与特定转录因子/组蛋白修饰结合的DNA片段；qPCR 技术使用SYBR荧光染料，非特异性的掺入DNA双链，发射荧光，保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步，利用Ct值进行定量分析。 ChIP-qPCR能够专一，灵敏，快速，高重复地定量生物样品中特定转录因子/组蛋白修饰与已知基因启动子的结合。   虹舜生物为您提供ChIP-qPCR技术服务，您只需要提供保存完好的标本及标本信息，虹舜生物就可为您完成全部实验操作，包括超声打断基因 组、染色质免疫共沉淀、IP与 Input DNA片段线性扩增、图像采集和数据分析,提供给您完整的实验报告.               ChIP-qPCR技术特点：     · 高特异性，针对感兴趣的基因启动子设计特异性的实时荧光定量PCR引物；     · 超宽的线性范围，可跨越7个数量级；     · 精确度高，重复性好；     · 灵敏度高   ChIP-qPCR技术服务流程：     A. 样品交联，甲醛处理细胞，交联DNA与DNA结合蛋白     B. 超声打断染色质，裂解细胞，并以超声波将染色质打断成400-500bp的片段     C. 染色质免疫共沉淀，将B所得片段分成两份，一份与特异性抗体进行免疫共沉淀(ChIP)，另一份作为Total input样品     D. DNA纯化，将C所得两份蛋白-DNA复合物解交联，纯化分离DNA片段。ChIP富集的DNA片段(ChIP DNA)，Total input样品中的DNA片段(Total input DNA) E. 实时荧光定量PCR检测   F.实验数据处理   ● Total input DNA样品作为模板，用待测基因特异性引物进行qPCR，检测得到Ct值(Input)   ● ChIP DNA样品作为模板，用待测基因特异性引物进行qPCR，检测得到Ct值(ChIP)   ● 待测基因免疫共沉淀的效率(ChIP / Total input)可通过以下公式计算：     %(ChIP / Total input) = 2^[ Ct (Input)- Ct (ChIP) ] * 100

 
ChIP-qPCR样品准备：
悬浮细胞：

1. 取10⁷悬浮细胞低速离心，用10ml培养基将细胞沉淀重悬于50ml离心管中；
2. 加入270ul 37％的甲醛，轻轻混匀，室温孵育10分钟；该步骤Z好在通风橱中完成；
3. 加入1ml 1.25M的苷氨酸，轻轻混匀，室温孵育5分钟，中和甲醛；
4. 2000×g离心5分钟，弃上清，用预冷的1×PBS/EDTA洗细胞两遍；
5. 2000×g离心5分钟，弃上清；
6. 收集到的样品－80℃冻存，干冰运输

贴壁细胞：

1. 将10cm培养皿中（10⁷细胞）旧的培养基吸掉，添加10ml新鲜培养基；
2. 加入270ul 37％的甲醛，轻轻混匀，室温孵育10分钟；该步骤Z好在通风橱中完成；
3. 加入1ml 1.25M的苷氨酸，轻轻混匀，室温孵育5分钟，中和甲醛；
4. 将皿中的混合液吸掉，用预冷的1×PBS/EDTA洗细胞两遍，加入1ml含有1×protease inhibitor cocktail的1×PBS，用细胞刮将皿底的细胞刮下，收集到1.5ml离心管中；
5. 2000×g离心5分钟，弃上清；
6. 收集到的样品－80℃冻存，干冰运输

注：
1、所使用的1.5 ml冻存管或离心管、枪头等必须高温灭菌，装好样品后管口需要以封口膜封好。
2、快递运输所用干冰量至少为8公斤，且运输用泡沫箱需用封箱带密封。