| 实验步骤 | 材料
缓冲液和溶液
试剂、缓冲液，储液的组成参见附录 1, 储液使用前稀释到适当浓度。
dATP(0.1 mmol/L)
这些反应混合液可通过混合 dNTP 和 ddNTP 储液制备，参见表 12-7。
甲酰胺上样缓冲液
TM 缓冲液
50 mmol/LMgCl2
Tris-Cl(1mol/L,pH8.0)
酶和缓冲液
大肠杆菌 DNA 聚合酶ⅠKienow 片段（5u/ul)
浓度约为 0.5pmol/ul(约 3.3ng/ul), 溶于水中。
浓度约 0.05pmol/ul, 相当于约 0.15ug/ul 的 M13 噬菌体单链 DNA。
[a-32P]dATP(3000Ci/mmol,10mCi/ml) 或
[a-35S]dATF(1000Ci/mmol，10mCi/ml) 或
寡核苷酸引物（1ug/ml, 约 160pmol/m]) 4ul
Klenow 酶（约 2.5 单位） 1ul
或
在室温至 37°C 温度范围内.Klenow 酶都能很好地催化延伸/终止反应和示踪反应。
7. 溫育后，沿每一个 C、T、A、G 管或孔壁加入 1ul 的示踪液。总共温育 10~12 min 后，离心 2s, 使示踪液混入到延伸/终止反应液中。再在室温下温育 10~12 min。
8. 第二次温育 9~11 min 后，沿每一个 C、T、A、G 管或孔壁加入 6ul 甲酰胺上样缓冲液。不要让溶液滑入聚合反应液中。温育结束，离心微量离心管或微量滴定板终止测序反应。
9. 反应物在-20°C 时可最多保存 5 天，也可以用变凝胶电泳直接分析见方案 8、9 或 10、11 和 12)。热变性后（100°C,2 min), 在冰上快速冷却。取 C、T、A 和 G 反应物各 3ul 加入测序凝胶各孔中。 |
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