| 实验步骤 | 一、材料
1. 缓冲液和溶液
(1) 氯仿
(2) 乙醇
(3) 异丙醇
(4) LiCl ( 5 mol/L)
(5) PEG-MgCI2 溶液
(6) 酚：氯仿（1:1，V/V）
(7) 乙酸钠（3 mol/L, pH 5.2 )
(8) TE ( pH 8.0 )
(9) TE ( pH 8.0）含 20 μg/ml RNase A
2. 核酸和寡核苷酸
粗制质粒
3. 离心机和转头
Sorvall SS-34 或与其相当的转头
4. 专用设备
冰水浴
二、方法
1. 将 3 ml 粗制质粒转移到 15 ml Corex 管中，在冰浴中冷却至 0℃。
2. 加入 3 ml 冰预冷的 5 mol/L LiCl，混匀，于 4℃ 离心 12000 g ( Sorvall SS-34 转头，10000 r/min ) 10 min。
3. 转移上清至 30 ml Corex 管中，加等体积异丙醇，混匀，室温离心回收核酸，12000 g ( Sorvall SS-34 转头，10000 r/min ) 10 min。
4. 小心倒去上清，倒置管口，使液体流干。室温下用 70% 乙醇洗沉淀和管壁。小心将乙醇倒去，用真空抽吸器将管壁上残留的乙醇抽干。在纸巾上倒置数分钟，使无可见乙醇残留。但应使沉淀保持湿润。
5. 用 500 μl 含 RNase A 的 TE ( pH8.0 ) 溶解湿润的核酸沉淀。将溶液转移到微量离心管，室温放置 30 min。
6. 将质粒-RNase 混合物用酚：氯仿抽提一次，然后用氯仿抽提一次。
7. 用标准的乙醇沉淀法回收 DNA。
8. 将质粒 DNA 沉淀用 1 ml 灭菌水溶解，再加入 0.5 ml PEG-MgCl2 溶液。
9. 室温放置超过 10 min，然后于室温用微量离心机在ZD速度离心 20 min, 以回收沉淀的质粒 DNA。
10. 沉淀用 0.5 ml 70% 乙醇重悬以去除微量 PEG, 用微量离心机在ZD速度离心 5 min 以回收核酸。
11. 吸去乙醇，重复步骤10。第二次洗涤后，在离心管架上放置 10~20 min, 使乙醇挥发。
12. 湿润的质粒沉淀用 500 μl TE ( pH 8.0 ) 溶解。以 1:100 用 TE ( pH8.0）稀释后测 OD260 并计算质粒 DNA 的浓度。按 1OD260 =50μg 质粒 DNA/ml 计算。
13. 分装 DNA 并保存于 -20℃。 |
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