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GXT载体PCR克隆试剂盒（ccdB T-vector PCR Clo...

产品信息
GXT载体PCR克隆试剂盒（ccdB T-vector PCR Cloning Kit）

产品概述

在PCR过程中，Taq酶会在PCR产物的3'末端加上一个A，利用这个特点采用T载体可以方便地克隆PCR产物。本产品用pEcoRV Vector作为克隆的T载体，该载体在E.coli自杀基因ccdB（Control of cell death）的上游启动子内引入一个EcoRV位点，并且加上T。如果自连产物转化E.coli后，ccdB基因则会表达，表达蛋白会破坏细菌的DNA gyrase，造成细菌染色体的降解导致细菌死亡（阴性克隆）；载体插入外部片段的时候，破坏了ccdB的读码框，使载体能在E.coli中扩增（阳性克隆）。这样避免了蓝白斑筛选等繁琐工作，使PCR产物克隆简单快速。

用途

  • Taq酶的PCR产物克隆
  • 用于taq酶PCR产物的测序（M13+primer）

储存条件

冰袋运输；长期保存-20℃（12个月以上）；10x T4 DNA ligase Buffer 中含 ATP，为避免ATP的降解，建议解冻后的10x T4 DNA Ligase Buffer 分装成小包装并在-20℃保存。

产品特点

  • pEcoRV-T载体自连产物转化大肠杆菌，大肠杆菌菌落<5个/10平板。
  • pEcoRV-T载体和Control insert连接转化大肠杆菌，大肠杆菌菌落>1000个/平板。

试剂盒组成

T4 DNA Ligase 10x T4 DNA Ligase Buffer pEcoRV-T vector Control insert
10 U/µL 400 mM Tris-HCl，pH 7.6
100 mM MgCl2，100 mM DTT
5 mM ATP		 20ng/µl 20ng/µl

使用示例

  1. 以 10μl 连接体系示例，在微量离心管中加入以下各种成分：
    试剂 使用量
    pEcoRV-T Vector（20ng/µl） 10ng
    Insert DNA 3:1 to 10:1 （molar ratio over vector）
    10X T4 DNA Ligase Buffer 1µl
    T4 DNA Ligase（10U/µL） 1µl
    ddH2O Up to 10µl
  2. 16℃反应30min；
    • 室温（25℃）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低
    • 保温5min也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低
    • PCR产物（2Kb以上）进行DNA克隆时，连接反应时间请延长至数小时
  3. 连接产物（10µl）加入100µl DH5a（或者*0）感受态细胞中，冰中放置30min；
  4. 42℃加热45秒后，再在冰中放置2min；
  5. 加入500µl LB培养基，37℃培养30min；
  6. 在含有Kan+的LB琼脂平板培养基上培养，37℃过夜，形成单菌落，计数；
  7. 挑选菌落，用PCR方法确认插入片段的长度。

克隆结果示例

Control Insert 连接/转化效率（cfu/ug Vector） 阳性菌落比率 效率（%）*
1 5.0 x 107 98.5 98以上
2 5.0 x 107 97.0 95以上
* 效率值菌落中的目的DNA insert片段的连入效率。

注意事项

  • 连接酶：
    • T4 DNA连接酶要求Mg2+，因此螯合Mg2+的EDTA的存在会阻碍反应；
    • NaCl或KCl浓度大于200mM时强烈YZT4 DNA Ligase；
    • 65℃孵育10分钟或70℃孵育5分钟可以导致T4 DNA Ligase失活；
    • 聚乙二醇（PEG） 极大地增加平末端连接效率。
  • 插入片段：
    • 如果Insert DNA 太小（<100bp），不能够完全破坏ccdB的启动子，将造成筛选失败;
    • Insert DNA应该是taq酶（货号T004）扩增、胶回收纯化处理后才进行载体连接，尽量避免其他杂带的存在;
    • PCR产物（2Kb以上）进行DNA克隆时，连接反应时间请延长至数小时。
  • 感受态细胞的选择：
    • 转化时请使用GX的热转化感受态细胞（转化效率≥1X108cfu/µg pUC19），这样才可能得到比较理想的阳性克隆。
  • 克隆产品测序引物：M13 reverse primer, M13（-40） forward primer （见附图）
    pEcoRV T-Vector 载体结构图： 

产品规格

货号 规格 包装规格
T4 DNA Ligase（10U/µL） 10X buffer pEcoRV Vector（20ng/µl） Control insert（20 ng/µl）
MCK002-20 20T 40 µl 200 µl 25µL 20µL
MCK002-100 100T 200 µl 1 ml 125µL 100µL

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  • Taq酶
    产品货号 T004-S T004-M T004-L
    产品规格 500U 2000U 10000U
  • 高保真平端PCR克隆试剂盒
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