逆转录PCR（RT-PCR）实验案例介绍

实验材料：细胞样品4份，分组编号（见图片标示）
试剂：Trizol Reagent,Invitrogen  Cat.5596-026；ReverTra Ace-α-TM  First Strand cDNA Synthesis Kit ,TOYOBO #FSK-100；PCR Master Mix（2x） Fermentas # K0172；DNA Marker DL2，000， TaKaRa D501A；0.1% DEPC水、氯仿（分析纯）、异.丙醇（分析纯）75%乙醇；AGAROSE(琼脂糖)  AMRESCO，K499；10×DNA上样缓冲液, 美国ProMab,SJ-R2008523；0.5mg/ml EB 溶液，实验室常备；1×TBE, 实验室常备，配方参照《分子克隆实验指南 第二版》
仪器：PCR仪,ABI9600；电泳仪，北京六一仪器公司，DYCP-31DN型；高速离心机，湘仪H1650-W； 紫外分光光度计，上海江仪仪器有限公司，UV-7502C(751)；成像系统，柯达紫外显相系统 400W像素
引物资料：
Homo- XXXX-F    5- cacccatgtctaccaaagtt -3，Homo- XXXX-R    5- ctctcaaaattccagtccag -3，片段长度: 175bp
Homo-GAPDH-F   5-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3，Homo-GAPDH-R   5-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3，片段长度   450bp
实验步骤：
1、RNA提取：每样本加入1ml Trizol试剂消化(组织约50mg—100mg充分剪碎，细胞约106—107)；匀浆样品在室温静置5~10min后加入0.2倍体积的氯仿，震荡15秒后在2~8℃下12,000×g离心15min；将水样层转移至干净的试管，加入0.5倍体积的异.丙醇，混匀后-20℃下静置10-15min，在2~8℃下12,000×g离心10min；移去上层悬液，将RNA沉淀用1ml 75%乙醇洗涤，在震荡器上混匀后2~8℃下7,500×g离心5min，弃去上清液；适度干燥RNA沉淀后，加入适量0.1% DEPC水，使RNA完全溶解；2000rpm离心20sec
2、总 RNA 定量：紫外分光光度计开机预热30 min；用蒸馏水洗涤石英比色皿，吸水纸吸干，加入DEPC水后，放入样品室的S池架上，关上盖板；设定紫外光波长（260nm、280nm）后校零（每次检测前均需调零）；将待测样品适当稀释（RNA 1μl用DEPC水稀释至250μl）后，记录编号和稀释度；把装有稀释后待测样品的比色皿放进样品室的S架上，关闭盖板；分别测定260nm和280nm波长时的OD值（吸光度在0.1—0.5范围为）；用蒸馏水洗涤石英比色皿，酒精浸泡。
3、实验结果判断：纯DNA：OD260/OD280≈1.8(＞1.9,表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白质、酚等污染） 纯RNA：OD260/OD280≈2.0（＜1.7时表明有蛋白质或酚污染；＞2.0时表明可能有异硫(CN)2酸残存）

样本编号	稀释倍数	A260	A280	A260/A280	RNA浓度(ug/ul)
YYYY	250	0.348	0.179	1.944	3.48
AAAA	250	0.289	0.151	1.914	2.89
BBBB	250	0.302	0.159	1.899	3.02
CCCC	250	0.333	0.171	1.947	3.33

计算A260/ A280比值，比值≥1.8，满足实验要求。        
RT-PCR实验步骤：略
产物用琼脂糖凝胶电泳检测：扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳,加样量为10μl（DNA样本8μl+上样缓冲液2μl） ,电压120V ,电泳完毕后在溴化乙锭( EB)中染色约15分钟，清水漂洗后凝胶成像系统拍照。
凝胶图片与平均光密度值：阳性条带以Gel pro4.0 版凝胶光密度分析软件进行分析，测其IOD值。
 点样说明及IOD参考值分析：

泳道	1	2	3	4
样品	YYYY	AAAA	BBBB	CCCC
XXXX基因	15930	8099	10591	12963
R值	0.603	0.325	0.438	0.545
泳道	5	6	7	8
样品	YYYY	AAAA	BBBB	CCCC
GAPDH	26431	24934	24206	23786

R值为目的基因PLSCR1参考IOD值/内参基因GAPDH参考IOD值
XXXX基因在YYYY细胞中表达量Z突出。