NF-KB 转录因子介绍：核转录因子NF-kappaB（NF-kB）是一种重要的转录因子，参与调控多种与炎症、抗凋亡、肿瘤形成和转化有关的基因表达。NF-kappaB（NF-kB）Z初被鉴定为在B细胞中和免疫球蛋白k轻链的增强子结合。但随后在非B-细胞的细胞质中被发现，形成NF-kB和IkB的复合物。Z初在DNA结合蛋白复合物中分离的NF-kB是由p65(RelA)和p50构成的异源双聚体。其他分离的单体包括p49（也可称为p52），p75（c-Rel）,p68(RelB)。p65，p68，p75单体起反式激活作用。p50，p49（p52）单体具有DNA结合活力，但只具有微量的反式激活作用。据报道p49和NF-kB的单体p65形成具有转录活力的异源双体，类似于p50/ p65异源双体。p49/ p65和p50/ p65异源双体在细胞质中受一种叫IkBa/MAD-3的YZ剂调节。
IkB和p65单体结合，阻制了细胞核中的定位和DNA的结合。在体外高浓度的p65能形成同源双聚体，能和DNA微弱地结合。Poly(dI:dC)能YZ这一反应（14）。p49和p50也能形成同源双聚体，但在细胞中的浓度很低。通常，在作NF-kB的凝胶迁移实验时，在20ul的反应体积中，有溶于10 mM HEPES的0.28pmoles 的NF-kB9寡核苷酸（pH7.9), 50mMKCl, 0.2mMEDTA, 2.5mM DTT, 10%甘油, 0.05%NP-40。当用纯化的蛋白时，250-300ng足以形成凝胶迁移复合物，而需用10ug的HeLa细胞核抽提物。凝胶迁移复合物在室温中保温30分钟，在50mMTris(pH8.3)和38mM甘氨酸的7%聚C
3H
5NO凝胶电泳中分离凝胶迁移复合物。
NF-KB p65活性检测原理：NF-KB p65磷酸化（活化形式）以后存在于细胞核内，可以直接和胞核内某些因子或基因启动子结合，启动一序列生理或病理生理效应。本方法通过提取组织或细胞核蛋白，利用不同形式的NF-Κb p65抗体捕获细胞核蛋白并加以区分，通过酶标仪450nm处测定核蛋白标准品与NF-Κb p65吸光度值，进行定量比较，从而明确p65蛋白的活化度。
含考马斯兰和二CH
3OH蓝色素的加样溶液只能加入到阴性对照反应中，因这两种色素会加剧NF-kB复合物的解离。当用HeLa细胞核抽提物作为结合蛋白来源时，可形成两种序列特异的凝胶迁移复合物，即p50/p50同源双聚体和p50/ p65异源双聚体。在表达p49，p50，p65的细胞中，可检测到4个序列特异的凝胶迁移复合物（p49/ p49，p50/ p50，p50/ p65，p49/ p65），如果存在高浓度的p65，可检测到微量的p65/p65。
下列试剂可加强NF-kB在体外的结合：mM的GTP，ATP，精胺，亚精胺，钡或钙离子，ng的Co+3(NH3)6（12）。
提取组织或细胞核蛋白，利用不同形式的NF-Κb p65抗体捕获细胞核蛋白并加以区分，通过酶标仪450nm处测定核蛋白标准品与NF-Κb p65吸光度值，进行定量比较，从而明确目的蛋白的活化度。
标本收集、保存与运输：1. 组织样品：新鲜组织放入液氮或-70℃保存，组织不少于100mg
2. 培养细胞：通过细胞计数取不少于2×106个细胞于EP管，加入0.5 ml生理盐水或蛋白保护剂，混匀后冷冻保存于冰箱（-70℃，避免反复冻融）
3. 血液细胞：以抗凝管保存血样或以淋巴细胞分离液分离细胞后加入0.5 ml生理盐水或蛋白保护剂，混匀后冷冻保存于冰箱（-70℃可长期保存，避免反复冻融）
4. 血清标本：离心去掉杂质后取上清入EP管，冷冻保存于冰箱（4℃可保存15-20天，-70℃可长期保存，避免反复冻融）
5. 细胞培养液：同血清标本
6. 蛋白溶液需要尽量新鲜，近期提取的样品并且保存方式得当
7. 样本运输：干冰
