明胶酶谱实验

大鼠心脏组织明胶酶谱MMP活性检测实验

实验仪器：
泳电源Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell,Mini Teans-Blot Module,and PowerPac Basic Power Supply (BIO-RAD,Catalog#165-3323)；电泳仪及附件Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell (BIO-RAD,Catalog#165-3301)

实验标本：
大鼠心脏组织20个
 
实验试剂：
1、凝胶试剂：30%C3H5NO溶液；Tris-Base（SIGMA）；10%SDS（SIGMA）；10%(NH4)2S2O8；TEMED（sigma）
2、常用溶液及缓冲液：制备含MMP底物蛋白SDS-PAGE凝胶：采用8%分离胶。将20Xsubstrater融化，并90℃加热5分钟。分别在浓缩胶和分离胶中加入20Xsubstrate并使之稀释20倍，混匀，然后再加入过liu酸铵和TEMED，等待凝胶聚合。

A．5%积层胶所用溶液

按总体积	2.5ml
ddH2O：	1.575ml
30%C3H5NO溶液：	0.42ml
1.0mol/L Tris (PH=6.8)：	0.315ml
10%SDS：	25ul
20Xsubstrate：	125ul
10%(NH4)2S2O8：	25ul
TEMED：	3ul

B．8%分离胶溶液

按总体积	10ml
ddH2O：	4.1ml
30%C3H5NO溶液：	2.7ml
1.0mol/L Tris (PH=8.8)：	2.5ml
10%SDS：	100ul
20Xsubstrate：	500ul
10%(NH4)2S2O8：	100ul
TEMED：	6ul

C．电泳缓冲液，1L
3g Tris-Base、14.4g 甘氨酸、1g SDS，加蒸馏水至IL，pH应该在8.3左右。也可以制成10×的储存液，在室温下长期保存。
 
检测步骤：
A、 阳性对照及待检测样品的前处理及上样 阳性对照：取5ul positive mixture与2XSDS-PAGE non-reducing buffer 等体积混合。待测样品5ul则1：1稀释于2XSDS-PAGE non-reducing buffer，混合后直接上样。不加热变性，并且仅使用不加还原剂的上样缓冲液。每孔点样10ul。
B、电泳 30mA恒流电泳45min，溴酚蓝跑出凝胶前沿时结束电泳。
C、洗涤凝胶 驱除凝胶，去除压缩胶。放入容器中，先用适量蒸馏水冲洗凝胶。然后加入10ml 1Xbuffer A，室温漂洗凝胶2X15分钟。中间换液2次。
D、孵育 倒掉Buffer A。加入10ml 1Xbuffer B，室温孵育4小时。
E、显色 倒掉Buffer。加入SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液水平摇床上染色120min后，再采用脱色液（CH₃OH浓度为25% ,乙酸浓度为10 %）进行脱色60min。
F、条带扫描 将凝胶放在扫描仪上扫描。用非透射光扫描，显示调整为灰度。并分析IOD值。72 kDa为MMP-2，92 kDa为MMP-9
。

试剂盒组成与储存：
1. 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml µl, −20 ℃
2. MMP-2 and MMP-9 positive mixture 500 µl, −20℃
3. 10 × Substrate G, 50 ml, −20℃ 
4. 10 × Buffer A, 50 ml, 4℃
5. 10 × Buffer B, 50 ml, 4℃
6. 10 × Mem-Gel Stain, 50 ml, 4℃
 
实验结果：
注：阳性条带以Gel pro4.0 版凝胶光密度分析软件进行分析，测其IOD（integrated optical density）累积光密度参考值。(例如：1.33E+05=1.33×105)。   P: positive mixture   每孔点样蛋白约10ug

Lanes:	Lane1	Lane2	Lane3	Lane4	Lane5	Lane6	Lane7	Lane8	Lane9	LaneP
Rows	(IOD)	(IOD)	(IOD)	(IOD)	(IOD)	(IOD)	(IOD)	(IOD)	(IOD)	(IOD)
MMP-9	16200	20200	26700	33200	30474	43300	38600	35131	23500	60323
MMP-2	12535	101884	12974	12322.6	12170.2	11685	12481	9677.5	12522	16578
样本	1	2	3	4	5	6	7	8	9	P

 

Lanes:	Lane 1	Lane 2	Lane 3	Lane 4	Lane 5	Lane 6	Lane 7	Lane 8	Lane 9	Lane P
Rows	(IOD)	(IOD)	(IOD)	(IOD)	(IOD)	(IOD)	(IOD)	(IOD)	(IOD)	(IOD)
MMP-9	25390	25500	44900	42000	60300	43400	43100	36600	33400	67703
MMP-2	10120	12053	13797	15995	15138	13139	15800	12447	12514	14632
样本	10	11	12	13	14	15	16	17	18	P

 

Lanes:	Lane 1	Lane 2	Lane P
Rows	(IOD)	(IOD)	(IOD)
MMP-9	29000	66424	66935
MMP-2	3164.7	9350.6	13975
样本	19	20	P

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