酵母双(单)杂交 cDNA 文库构建实验服务

实验技术原理：酵母双杂交技术产生以来，它主要应用在以下几方面：(1）检验一 对功能已知蛋白间的相互作用。(2）研究一对蛋白间发生相互作用所必需的结构域。(3)用 已知功能的蛋白基因筛选双杂交cDNA文库，以研究蛋白质之间相互作用的传递途径。(4)分析新基因的生物学功能，即以功能未知的新基因去筛选文库。

ProQuest系统依靠报告基因的转录激活来鉴定蛋白相互作用。将一个基因克隆到'诱饵'载 体，pDEST32，并和GAL4蛋白的DNA结合域 （DBD）表达为融合蛋白。将第二个基因或者编码可能的相互作用子蛋白的cDNA文库克隆到'猎物'载体，pDEST22，同GAL4的转录激活域 （AD）表达为融合蛋白。当两个蛋白相互作用时，AD和DBD间距离被拉近，从而激活报告基因的表达。

 

实验操作流程：
1、提取总RNA，分离mRNA，反转录cDNA；
2、将cDNA与pDONR222载体进行BP重组反应，重组产物转化DH10B感受态细胞；
3、甘油保存大肠杆菌文库；
4、提取大肠杆菌文库质粒DNA，制备酵母感受态细胞；
5、大肠杆菌文库质粒DNA转化酵母菌，测定转化效率；
6、收集酵母转化子，测定文库效价；
7、甘油保存酵母菌文库。
使用优点：在拥有相关组织基因文库的情况下
a.可以用来比对病变组织更快的找到突变基因或者导致变异的蛋白，更快的找到攻克方向。
b.可以用作大规模的蛋白筛选，在较短时间内对找到某些药物对相关组织主要的作用蛋白，对于药物的修饰和改进明确方向。
c.可以反复使用，培养时间短，适合大规模筛选使用。
d.作用信号是在融合基因表达后， 在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。
e.检测在活细胞内进行， 可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。

 

实验注意事项：   
客户提供：
客户构建指定的酵母双杂交cDNA文库，由客户提供组织、细胞或总RNA给我们即可：
1、细胞样本：细胞数量大于1*10⁷ ，总RNA：大于200ug
2、动物样本：大于1g ；植物样本：大于2g 
交付标准：
1、酵母双杂交（酵母单杂交）文库质粒、菌液  
2、完整项目报告（材料、试剂、仪器、方法、数据分析、实验结果）
其他：
1、RNA的提取（例如Guanidine isothiocyanate法，盐酸胍—有机溶剂法，热酚法等等，提取方法的选择主要根据不同的样品而定）。
2、要构建一个高质量的 cDNA 文库，获得高质量的 mRNA 是至关重要的，所以处理 mRNA 样品时必须仔细小心。
3、由于 RNA 酶存在所有的生物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境，因此建立一个无 RNA 酶的环境对于制备优质 RNA 很重要。
4、文库构建要选择合适的载体，常规用的是λ 噬菌体，这是因为 λ DNA两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可用来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳大片段的外源DNA。
5、胶回收前电泳槽，电泳板，梳子等都要用1%的HCl浸泡。
6、胶回收时电压要稳定。