荧光定量PCR服务

荧光定量PCR服务
产品说明：
英睿生物提供快捷GX的实时荧光定量PCR(Real Time PCR,RT PCR)服务，所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。是一个常用的mRNA水平的基因表达定量技术。

 

服务内容

• 细胞/组织的基因差异表达检测，经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如药物处理、物理处理、化学处理等)，特定基因在不同时段的表达差异以及cDNA芯片或差显结果的确证。
• 组织/细胞样品中基因拷贝数的确定，DNA或RNA的相对和定量分析。包括病原微生物或病毒含量的检测，转基因动植物转基因拷贝数的检测，RNAi基因失活率的检测等。
• 基因分型，基因突变及多态性方面的研究。

收费标准

• 询价 服务周期

1. 从细胞或特定组织中提取总RNA：实验周期为细胞或组织送到后的2个工作日。
2. 逆转录实验：实验周期为1个工作日。
3. 扩增内参和目的基因，实验周期为10个工作日。因为在每种不同细胞或组织中不同的基因的扩增难度有差异，因此实验的时间会有所不同。我们一般会根据实验进程通知客户，确保客户在时间知道实验状况。
4. 回收内参和目的基因表达片段做标准样，并检测其扩增效果： 实验周期为2个工作日。
5. 上机Real Time-PCR检测得到结果并进行处理： 实验周期为2个工作日。

技术原理

Real-time PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。
实时荧光定量PCR技术具有特异性强，有效解决了PCR污染问题、自动化程度高等特点，做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定Ct值，从而根据Ct值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量。

技术流程

一、RNA的提取
二、DNase I 消化样品RNA 中的DNA
三、RNA琼脂糖凝胶电泳
四、RNA反转录为cDNA
Real-Time PCR引物设计的要求
① Tm=55~65 ℃
② GC=30~80%
③ PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80~300 bp之间都可。
④ 引物的退火温度要高，一般要在60 ℃以上。
五、cDNA与引物质量检测
选择特异性好，扩增效率高的引物作为实时荧光使用引物。
六、利用相对定量的方法分析目的基因表达量的情况：
常用的看家基因有β-actin，GAPDH，18S rRNA
七、定量 PCR检测
八、扩增曲线和溶解曲线
溶解曲线全部为单峰表明为特异性扩增，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。