全基因组甲基化测序

 

对于DNA甲基化的检测，目前采用：甲基化DNA富集并结合高通量测序（MBD-Seq, Methylated DNA Binding Domain-Sequencing）的方法。MBD-Seq的原理是：由于在哺乳动物中甲基化一般发生在CpG的胞嘧啶5位碳原子上，所以可通过特异性结合甲基化DNA的蛋白MBD2b或5’-甲基胞嘧啶抗体富集高甲基化的DNA片段，并结合第二代高通量测序，对富集到的DNA片段进行测序，从而检测全基因组范围内的甲基化位点。

 

 

技术路线

 

生物信息分析

DSAM-01	测序质量评估(QC)
DSAM-02	MBD-Seq序列与参考序列比对
DSAM-03	MBD-Seq序列比对的甲基化信息概况
DSAM-04	Peak calling
DSAM-05	Peak在基因上、基因间区的分布情况
DSAM-06	Peak在基因组区域富集程度统计
DSAM-07	Peak在基因组区域富集程度统计
DSAM-08	Peak区域功能注释和富集度分析
其他

 

样品要求：

1) 样品质量：OD 260/280值应在1.8～2.0 之间；无RNA污染。无降解（在琼脂糖电泳中，DNA的片段在23kb 的Hind III 酶切的lamda phage DNA的片段之后靠近电源的负极）.

2) 样品浓度：浓度不低于50ng/µl。

3) 样品总量：每个样品总量不少于15µg。

4) 样品溶剂：要溶解在无菌的10 mM TirsHCl， 1mM EDTAE (pH 8.0)溶液中。经过65C 10分钟处理（将可能存在的DNAase 灭活）；

5) 样品运输： DNA低温运输（-20℃）；且在运输过程中请用parafilm将管口密封好，以防出现污染。

 

 

应用案例

非小细胞肺癌（NSCLC）是一个复杂的恶性肿瘤，由于其异质性预后不良的诊断，预后和患者的ZL带来了许多挑战。 DNA甲基化是一个表观遗传调控在正常发育和癌症的重要机制。这是一个非常稳定和特别的模型，因此，是非常适合作为肿瘤表观遗传研究的代表。研究者采用了NSCLC样本和对照组肺组织进行全基因组DNA甲基化分析，结合MethylCap和高通量测序（MBD-seq），以提供全面的肿瘤和对照组肺标本的DNA甲基化图谱。结果通过重亚硫酸氢钠MethylCap序列数据验证。结果表明，重复实验内及实验组和对照组间的MethylCap-Seq数据均显示很强的正相关性