TUNEL细胞凋亡原位检测 （FITC标记POD法,冰冻切片专用）

TUNEL细胞凋亡原位检测
FITC标记POD法,冰冻切片专用）

• 目的和原理

       TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（FITC标记POD法）是用来检测细胞在凋亡过程中细胞核DNA的断裂情况，其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下,可以连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3‘－OH末端，可用荧光显微镜检测；荧光素亦可被抗荧光素抗体(anti-fluorescein antibody)标记,，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB）的存在下，产生很强的颜色反应（呈棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在普通光学显微镜下即可观察和计数凋亡细胞。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被标记或染色。本方法适用于组织样本（石蜡切片）的凋亡原位检测。

• 仪器设备

1）盖玻片、载玻片
2）染色缸
3) 离心机
4）普通光学显微镜

• 试剂

1) 多聚甲醛、
2）PBS、
3）H2O2 、
4）TritonX-100、
5）柠檬酸钠、
6）复染苏木素染液
7）凯基TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒
（四） 操作流程
       1. 检测样本的预处理
          a. 冰冻切片的预处理
          b. 阳性对照及阴性对照的准备
TUNEL检测同时需要设阳性和阴性对照，以显示试验的客观性及准确性。因此需要按下述方法准备两个样本来制备阳性及阴性片，其后续步骤与待测样本同样进行。
             A： 阳性对照样本的准备
                 组织样本（冰冻切片）在Triton X-100通透液处理、PBS浸洗后，再加入100μL DNase I反应液（冰冻切片：2000-3000U DNase I;细胞：1000-2000U DNase I;石蜡切片 3000-5000U DNase I，40mM Tris-HCl PH 7.9,10 mM NaCl, 6mM MgCl2, 10mM CaCl2）（用户自备）室温～37℃处理10～30 min，其余步骤均相同。如有问题详见Page 7.
B： 阴性对照样本的准备
在Page6标记反应制备TdT酶反应液时，不添加TdT酶，其余步骤均相同。
2. 标记和显色反应：
3. 常见问题的原因及推荐解决方案.
*TdT dilution buffer：60 mM KPB 缓冲液（pH7.2），150 mM KCl， 1 mM 2-mercaptoethanol， 50 % Glycerol

现象	可能原因	建议
非特异性染色（例如：非凋亡细胞的强染色）	Biotin-dUTP的非特异性结合	勿使细胞干涸 在TdT酶反应之后，再用含0.1% Triton X-100和1 mg/ml BSA 的PBS洗三次。
	TdT酶的浓度过高	用TdT dilution buffer* 作1：2—1：10稀释
	内源过氧化物酶未被封闭	封闭液室温（15-25℃）封闭10min（封闭液： 3%H2O2溶于甲醇）
	光照紫外线导致包埋试剂的聚合（如：甲基丙烯酸会导致样本DNA的断裂）	尝试改用其它包埋材料或其它聚合试剂
	在固定组织时样本DNA已断裂（内源核酸酶的作用）	确保样品取样后立即固定或通过肝静脉灌注固定
	固定后某些核酸酶活性依然较高导致DNA断裂	用含有dUTP和 dAPT的溶液封闭
染色背景较高	固定导致某些含黑色素前体的细胞染成黄色	尝试以甲醇固定，但可能会降低检测的敏感性。
	内源过氧化物酶未被封闭	封闭液室温（15-25℃）封闭10min（封闭液： 3%H2O2溶于甲醇）
	Biotin-dUTP的非特异性结合	在TdT酶反应之后，再用含0.1% Triton X-100和1 mg/ml BSA 的PBS洗三次。
	样本被支原体污染	使用支原体检测试剂盒检测，如阳性则制备未被污染的新样本
	标记反应试剂（TdT酶及dUTP）的浓度过高	稀释50%，以降低标记反应的浓度
	细胞处于高度增殖期	在非高增殖期取样检测
	DAB孵育时间过长	减少DAB染色时间
标记率低、染色淡至无	如果以乙醇或甲醇固定的样本则标记效率较低（因为在固定时染色质未能与蛋白质交联，而在操作中丢失）	用溶于PBS PH7.4中的4%多聚甲醛固定 或或戊二醛固定。
	过度的固定导致与蛋白过度交联	缩短固定时间，或用溶于PBS PH7.4的2%多聚甲醛固定
	促渗条件不佳，以致于试剂不能到达靶分子或浓度过低	l       增加通透剂促渗时间 l       增加通透剂的作用温度（15-25℃） l       优化蛋白酶K的作用浓度和作用时间（如：以400ug/ml作用5min） l       0.1M的柠檬酸钠70℃作用30min。