免疫荧光实验

一）目的和原理
    免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。
（二）仪器设备
 1）湿盒；
 2）恒温摇床；
 3）荧光显微镜；
 4）器械：盖玻片（处理：先下洗液，然后自来水冲洗，纯水冲洗，ddH₂O冲洗，烘箱烘干，放入75％的酒精中，使用前挥干酒精）、载玻片、镊子
（三）试剂
 1）PBS；
 2）4％多聚甲醛:PBS配(NaOH调pH值到7.2-7.4）,固定细胞；
 3）0.2％Triton X－100: PBS配；
 4）3%BSA: PBS配；
 5）一抗、二抗：均用PBS配；
 6）抗淬灭封片剂：试剂公司定购，直接滴加即可
（四）操作流程及注意事项
  1、贴壁细胞
       1） 取出六孔板中已贴壁好的细胞或者加过药的细胞爬片PBS洗三遍，每遍3～5min，每孔2mL。注意：加PBS冲洗不要将细胞冲下来，下面的每一步都应注意这点。此步的时间和次数可以适当减少。
       2）4％多聚甲醛室温固定20～40分钟，PBS洗三遍，每遍3～5min，每孔2mL。注意：多聚甲醛固定的时间由细胞状态而定，细胞状态较差，控制固定时间在30min以内，如果状态比较好，可以延长5～10min。
       3）0.2％Triton X－100， 4℃（放于冰箱中），透化20～30分钟，PBS洗三遍，每 遍3～5min，每孔2mL。注意：细胞状态较差时，控制时间在15～20左右
      4）3%BSA室温封闭1h
      5）将盖玻片从6孔板中用针或者镊子挑出，放于载玻片上，有细胞的一面朝上，滴 加一抗100µL～200µL， 4℃湿盒内过夜，也可37℃孵育1小时，前者效果好。注意：有细胞的一面朝上，夹盖玻片的时候小心，不要夹断玻片
      6）将盖玻片放回6孔板中，PBS洗三遍，每遍3－5min，每孔2mL。注意：此步的清洗很重要，可以延长清洗时间和清洗次数，可以保证本底比较干净。
     7）将盖玻片从6孔板中用针或者镊子挑出，放于载玻片上，有细胞的一面朝上，滴加二抗100µL～200µL，二抗室温1小时（避光），PBS洗三遍，每遍3－5min，每孔2mL。
     8）蒸馏水洗掉PBS，抗淬灭封片剂封片，-70℃避光保存。 注意：①还是染完之后没有封片前直接照效果好一些，因为有的时候可能封片会 出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会淬灭的。②荧光的 片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。
2、悬浮细胞
     1）1000rpm×5min离心收集细胞，PBS洗一次，离心收集
     2）-20℃预冷的甲醇100～150µL加入到细胞中，吹匀后快速滴加到6孔板中的盖玻片上，-20℃固定20～30min后，取出挥干甲醇（可以放在空调下吹，或者用电风机吹），尽量保证吹干，但是细胞又都在玻片上。
     3）下面的操作同贴壁细胞的3～8步，但是悬浮细胞比贴壁细胞更易吹掉，所以操作时更要小心，尽量保证细胞在玻片上。