免疫沉淀实验（Immunoprecipitation，IP）

 一）目的和原理
       免疫沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A"特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应。
（二）仪器设备
      1）轮转仪；
      2）常规垂直电泳装置
（三）试剂及配置方法
      1）抗体；
      2）protein A/G beads
一）目的和原理
  免疫沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A"特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应。
（二）仪器设备
      1）轮转仪；
      2）常规垂直电泳装置
（三）试剂及配置方法
      1）抗体；
      2）protein A/G beads
（四）操作流程
         免疫沉淀分三步：细胞裂解、抗原－抗体复合物的形成、免疫复合物的收集和分析。在哺乳动物培养细胞裂解液中进行免疫沉淀的经典方法是：

1. 取对数生长期细胞，接种于100mm培养皿或等底表面积的培养瓶中，12-18h后给药。
2. 取出药物处理后的细胞，弃培养基，于冰上用冷PBS冲洗两次，再用细胞刮子仔细将细胞刮下并收集至1.5mL离心管中，5000rpm，4℃离心4min，弃上清，加入蛋白质裂解液（临用前加入各蛋白酶YZ剂及DTT）。4℃放置30min~1h，12000rpm，4℃离心20~30min，吸取上清转移至新的离心管中。
3. 取上清30µL用于western blot，加入2×loading buffer，100℃变性5~10min，迅速置冰上，-20℃备用。
4. 剩余上清中加200μL 不相干的杂交瘤组织培养上清（若用单克隆抗体）或50μL免疫前血清（若用多克隆抗体），置4℃以下1h。此步可降低背景，因细胞蛋白对免疫球蛋白有非特异吸附。
5. 4℃，12000rpm，离心5min，弃上清。加入对应抗体10μL（~1μg/sample）及相应beads（20μL/sample），4℃轮转过夜。
6. 取出轮转过夜摇匀的混合物，4℃，12000rpm 离心5min，小心弃去上清。
7. 加入1mL冰PBS 清洗beads，4℃轮转10min，5000rpm， 4℃离心5min，小心弃去上清。重复四次。
8. 吸出并弃上清，加入2×loading buffer30μL，混匀，100℃变性5~10min，迅速置冰上，-20℃备用。
9. 临用前取出样品，12000rpm，4℃离心1min，吸取上清进行western blot实验。

（五）注意事项
      1）一般当需要低的非特异去污剂背景时，用RIPA裂解缓冲液；若要保留目标蛋白 的酶活性或需保护的蛋白复合物较重要，则应用温和去污剂。
      2）多种溶解方法可释放目标蛋白降解的胞内蛋白酶，为降低裂解物中蛋白酶的活性，可保存于低温（≤0℃），且在裂解缓冲液中加蛋白酶YZ剂。
     3）抗体性质：抗体不同和抗原结合能力也不同，免疫染色能结合未必能用于IP反应。要仔细检查抗体说明书，特别是多抗特异性问题。
     4）溶解抗原的缓冲液性质：多数抗原是细胞构成的蛋白，特别是骨架蛋白，缓冲液必须要使其溶解，必须使用含有强界面活性剂的缓冲液，尽管可能影响一部分抗原抗体的结合。若用弱界面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白，即便溶解也易与其它蛋白结合，抗原决定簇被封闭，影响与抗体的结合，即使IP成功，也会导致很多蛋白与抗体共沉。
    5）为防止蛋白的分解，修饰、溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶YZ剂，于低温下实 验。
    6）实验前先考虑抗体/缓冲液的比例，抗体过少不能检出抗原，过多则不能沉降在beads上，而残存在上清。缓冲剂太少不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。