| 实验步骤 | 材料
缓冲液和溶液
贮存液，缓冲液和试剂的成分参见附录 1。
参见附录 8。
微量营养（用于 10xMOPS 盐）
37 mg（NH4)6Mo7O24•4 H2O
158 mgMnCl2•4 H20
25 mgCuSO4
溶于10ml 终体积，过滤CJ，贮存于 4°C。
10XMOPS 盐（用于诱导培养基）
400 mmol/L3-(N-吗啉代) 丙磺酸（pH7T4)(MOPS)
0.1 mmol/L FeSO4•7 H2O
2.8 mmol/LK2SO4
5.3 mmol/LMgCl2•6 H2O
溶于 1L 终体积，过滤CJ. 用前每升加 10ul 微量营养。
中性磷酸盐缓冲液（1mol/L)(用于诱导培养基)
不含 DTT 的 1xSDS 凝胶加样缓冲液室温保存，1mol/LDTT 贮存液现用现加于上述缓冲液。
凝胶
SDS-聚丙烯酰胺凝胶（10%）
0.2%(m/V) 葡萄糖
20ug/ml 腺嘌呤
0.1mol/L 中性磷酸盐缓冲液（配方见上）
诱导 phoA 的低磷酸盐培养基 (Neidhardt et al,1974; 最初用于同位素标记）虽然配制麻烦，担总能获得ZG水乎的诱导。
含氨苄（50ug/ml) 的 LB 琼脂平板
含氨苄（50ug/ml) 的 LB 培养基
离心机和转头
Sorvall GSA 转头或相当的转头
本方案步骤 1 需要笫 8 章方案 7 中所列试剂。
本方案步骤 3 需要第 1 章方案 23~26 中所列试剂。
任何大肠杆菌菌株都可用作载体的宿主。Oka 等（1985）报道外源蛋白在 YK537 中比在 C600 中表达量髙 5 倍，YK537 菌株带有内部缺失突变的如 phoA 基因，但表达水平的差异可能并不是由突变造成的，因为 B.L.Wanner(个人通信）等发现外源蛋白在同基因野生型或 phoA8 菌株中的表达没有差异。如果外湎蛋白没有毒性，就可以使用带 phoR 突变的细菌菌株。因为野生型 phoR 基因编码操纵子的阻抑物，phoR 突变株组成表达/启动子控制的基因（Wanner1987)。对于所有的细菌表达系统可能都需要SY不只一种宿主，才能找到最适于表达特定外源蛋白的大肠杆菌菌株（Weikert et al.1988)。不同的菌株也应在不同的溫度培养，以获得ZG表达水平和蛋白稳定性（见方案 1)。
pTA1529 或 pBAce
为确定扩增反应没有引入错误突变，应对 PCR 产物进行序列分析。
2. 含靶 cDNA/基因的 DNA 片段与表达载体连接（第 1 章方案 17 或 19)。
3. 连接产物转化适当的大肠杆菌菌株。将转化体铺于含氨苄（50ug/ml) 的 LB 平板，于 37°C 过夜培养。
影响诱导表达的因素请参见方案 1 步骤 8 的注解。
7. 接种后不同时间（如 0、6、12、18 和 24 h) 取 1 ml 样品放于微量离心管中，测定 A550, 室温高速离心 1 min。
如果用 phoA 信号肽引导外源蛋白的分泌，进行补充方案 phoA 融合蛋白的亚细胞定位，通过分级分离分析蛋白在细胞中的分布。
大量表达靶蛋白
12. 挑取一个重组大肠杆菌菌落接入 25 ml 含氨苄（50ug/ml) 的 LB 培养液，在 125 ml 摇瓶中于 37°C 通气培养过夜。
13.5000 g(6500r/min Sorvall SS-34 转头）离心 15 min 收集细胞，沉淀重悬于 25 ml 诱导培养液，再次离心收集细胞。
14. 洗涤过的细胞重悬于 2.5 ml 诱导培养液，接种于 500 ml 诱导培养液，以预试验确定的ZJ时间和ZJ温度于 2L 摇瓶中培养。
15. 诱导适当时间后，于 4°C 以 4000 g(5000r/min Sorvall GSA 转头）离心 15 min 收集细胞。
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