cDNA 文库构建/EST 测序分析技术服务

实验技术简介：EST（Expressed Sequence Tag）表达序列标签是指随机从构建的cDNA文库中挑选克隆，并进行5'端和3'端一次性测序所获得的短cDNA部分序列，一般长度为 150～500bp。虽然EST只是完整基因的一部分，但是其序列长度已足以代表该基因，因此可以采用EST特异性记基因。目前，EST的数目比 GenBank中其他核苷酸序列多，所以在EST 库中更容易搜寻到新的基因，它已被广泛地应用于基因的识别。另外，由于EST 来源于特定组织在特定环境下总mRNA所构建的cDNA文库，因此EST也能说明该组织中各基因的表达水平。

实验技术原理：大规模cDNA测序为基础，即提取生物体的mRNA，进一步获得 cDNA文库，挑选其中300-500bp的部分（即EST序列）进行序列测定，然后通过 生物信息学手段得到全长的基因序列。通常EST序列位于一段cDNA的3’-端非翻译区，也可以在该cDNA中随机选取。利用EST技术克隆基因及功能分 析，使克隆和定位新基因的策略发生了巨大变革。

 

实验操作流程：
1、构建cDNA文库
2、DNA测序
3、信息处理和管理
4、基本信息分析
a.从峰图到序列的转化，去除低质量的序列和载体序列
b.序列拼接
c.EST注释
d.ORF预测及分析
e.基因注释（NR、NT数据库）
5、高级信息分析
a.功能蛋白分析
b.Interpro功能域分析
c.序列属性及其对应Unigene的分析
d.COG分析
e.Pathway分析

 

实验注意事项：
客户提供：
1、样品量：细胞样品请提供至少5×10⁶个细胞，组织样品请提供至少100mg的组织块或切片。DNA样品请提供2μg以上的基因组DNA。
2、样品质量：DNA无明显降解，OD260/280值在1.7～1.9之间，浓度≥ 50ng/μl。
3、样品保存：细胞样品或新鲜组织块（切成～50mg的小块）用液氮速冻后，-80℃保存。DNA样品可溶于的超纯水或TE（PH8.0）中，-20℃短期保存或者-80℃长期保存。样品保存期间避免反复冻融。
4、样品运输：细胞或组织样品置于1.5 ml管中，封口膜封好，干冰运输。DNA样本放离心管或者PCR板中，密封后，冰袋运输。
5、目的基因或转录因子的相关背景资料。
交付标准：
完整项目报告（材料、试剂、仪器、方法、数据分析、实验结果）