CRISPR/Cas9基因敲除

一、CRISPR/Cas9技术介绍
1、CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是新出现的一种由sgRNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)是成簇的、规律间隔的短回文重复序列，是生物体为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。在这一系统中，sgRNA引导序列靶定位点剪切双链DNA达到对基因组DNA 进行修饰的目的。有很多CRISPR–Cas系统需要多种蛋白的参与，然而在多数细菌的胞内都只需要一种内切酶（endonuclease）——Cas9足矣，我们也将这种CRISPR/Cas系统称作Ⅱ型系统（type II systems）。Ⅱ型CRISPR/Cas系统的发现，使RNA介导的基因组编辑技术成为简单、方便、快速的功能基因组学研究工具。
2、CRISPR/Cas9的基本原理：步通过对预设的DNA位点进行切割，造成DNA断裂（DSB, double strand break）；第二步通过细胞的DNA修复机制对DNA断裂点进行修复，从而产生需要的突变结果。
3、修复机制主要包括两种途径：
  1）非同源末端连接途径（NHEJ，Non-homologous end joining）：NHEJ是细胞内主要的DNA断裂损伤修复机制，但保真性低。此修复机制非常容易发生错误，导致修复后发生碱基的缺失或插入（Indel），从而造成移码突变，达到基因敲除的目的。  
  2）同源介导的修复（HR, homology-directedrepair）：此修复机制保真性高，但发生概率低。在提供外源修复模板的情况下，靶向核酸酶对DNA的切割可以将同源重组发生的概率提高约1000倍。 利用这种机制可以实现基因组的精确编辑，如：条件性基因敲除、基因敲进、基因替换、点突变等等。

4、CAS9是一种核酸酶，可通过crRNA和tracrRNA(或反式激活crRNA)的介导实现特异DNA序列的剪切。介导RNA（gRNA）的设计可包含模拟tracrRNA-crRNA复合体的发卡结构，而CA9的特异性结合基于gRNA和PAM序列（三个核苷酸NGG序列，也称protospacer adjacent motif sequence）。因此，作为位点特异性的基因组编辑工具，CRISPR/Cas9系统必须要有Cas9核酸酶和gRNA。

5、CRISPR/Cas9/gRNA（CRISPR-Cas RNA-gudide nuclease）基因敲除技术是继TALEN基因敲除技术之后又一大突破。与TALEN和ZNF技术相比，CRISPR/Cas9系统的载体构建和使用更加方便。基因敲除的特异性由gRNA而不是蛋白来确定，因此避免了复杂的质粒组装构建过程，甚至使同时敲除多个基因成为可能。不仅如此，实验表明CRISPR/Cas9系统的基因敲除效率与TALEN、ZNF的效率相当或者更好。目前Cas9的特异性及其它一些特性尚有待进一步研究，但由于其操作极其简便，该技术的应用将大大简化育种，遗传变异修复，及各种基因研究的工作难度。
嘉美实验提供动物细胞Cas9基因编辑服务、大肠杆菌基因编辑服务以及CRISPR SAM服务。

二、哺乳动物细胞Cas9基因编辑服务
哺乳动物细胞Cas9基因编辑服务采用质粒转染法转入Cas9蛋白/sgRNA表达质粒和重组修复模板，通过抗性基因筛选出阳性细胞。嘉美实验有着丰富的细胞株构建经验，可为实验委托者提供基因编辑多克隆株、单克隆株筛选服务。
现在可提供的服务项目包括实验方案设计、基因敲除载体构建、基因敲入、基因敲除、定点突变等。
 
1、服务内容：
  1）靶点设计，构建Cas9基因敲除质粒。
  2）靶点敲除效率检测。
  3）Cas9质粒/重组模板转染目的细胞。
  4）挑选单克隆细胞，检测细胞基因型。
 
2、两种实验方案对比：无痕/重组Cas9动物细胞无痕基因编辑流程  Cas9动物细胞重组基因编辑流程
 
三、大肠杆菌E.coli Cas9基因编辑服务
大肠杆菌（Escherichia coli）是Z重要的模式生物之一。嘉美实验大肠杆菌基因编辑服务采用CRISPR/Cas9技术，可以实现单个基因敲除、多个基因敲除、基因敲入、定点突变等。大概3-4周可以完成整个实验。基因编辑不残留任何抗性基因等编辑痕迹。
 
服务内容：
1、设计实验方案。
2、构建Cas9基因编辑载体。
3、转化菌种。
4、挑选细菌克隆，检测基因型。
5、清除质粒，修复抗性敏感性。四、CRISPR dCas9转录激活服务
1、CRISPR dCas9 SAM技术介绍：CRISPR SAM（synergistic activation mediator）采用切割活性缺失的dCas9蛋白融合VP64转录激活蛋白，加上能与RNA结合蛋白MS2的sgRNA2.0，特异性识别并结合目标基因的启动子。MS2蛋白上连接p65和HSF1转录激活蛋白。通过多种转录激活蛋白的协同作用，能更好的模拟细胞内转录激活（下图为：CRISPR/Cas9 SAM原理）。研究表明，单一位点SAM的转录激活效果远高于多个位点dCas9-VP64的转录激活效果。
 CRISPR/Cas9 sam原理图
（来自Konermann，et al. Nature, 2015）
2、CRISPR SAM组成：
  1）pLV-dCas9-VP64：慢病毒载体，表达无DNA酶的dCas9与转录激活因子VP64的融合蛋白。与sgRNA结合并产生转录激活作用。
  2）pLV-MPH：慢病毒载体，表达MS2/P65/HSF1融合蛋白。与sgRNA结合并协同产生转录激活作用。
  3）pLV-SG20：表达改造的sgRNA，与DNA上靶点特异结合，并且结合dCas9及MS2蛋白。
 
3、嘉美实验能提供：
  1）CRISPR SAM慢病毒载体：pLV-dCas9-VP64、pLV-MPH、pLV-SG20。
  2）可直接转染细胞的慢病毒：dCas9-VP64表达慢病毒、MPH表达慢病毒、SG20表达慢病毒。
  3）dCas9-VP64&MPH稳定表达细胞株。
  4）已验证的转录激活sgRNA表达载体。
  5）特定基因转录激活细胞株。
  6）pLV-SG20载体构建服务：CRIPSR SAM靶点设计及载体构建。
  7）目标基因转录激活稳定细胞株构建服务。
五、CRISPR/Cas9载体构建服务
CRISPR/Cas9载体构建服务包括基因编辑实验方案设计、靶点筛选验证、基因编辑载体构建及配套重组载体构建。该服务可以为委托者提供可用于转染的质粒以便您直接开展基因编辑实验。实验委托者可以根据需要选择其中的部分服务。CRIPSR/Cas9载体构建服务采用我pCas9gRNA7系列载体。该载体使用了Cas9-HF1突变体，在保证切割效率的同时，限度地减少脱靶率，极大地提高基因编辑的成功率。无论您需要基因敲除、敲入还是定点突变，pCas9gRNA7系列载体中丰富的载体类型均可以满足您的实验需要。
 
服务优点：
1、完整的全套服务
2、特色靶点筛选服务，确保基因编辑成功
3、适合各种基因编辑
4、方案完善的技术支持

服务流程：更多具体实验咨询，请联系嘉美实验